轉(zhuǎn)基因技術在棉花育種中的應用楊金惠812031001作物領域2012級摘要：棉花是一種重要的經(jīng)濟作物，在我國廣泛種植。培育轉(zhuǎn)基因棉花被看作是解決產(chǎn)量和生態(tài)環(huán)境問題最根本和最有效的方式。本文介紹了轉(zhuǎn)基因棉花主要的研究方法，包括轉(zhuǎn)化方法以及轉(zhuǎn)入的基因等，并對轉(zhuǎn)基因棉花的發(fā)展趨勢作了相關探索。此外，本文總結(jié)了轉(zhuǎn)基因技術在棉花遺傳改良中的應用，包括棉花抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆以及品質(zhì)改良等方面的最新進展，并對棉花轉(zhuǎn)基因研究中存在的主要問題和今后的研究與應用前景進行分析和展望。關鍵詞：轉(zhuǎn)基因；棉花；育種1973年美國科學家科恩等人第一次將兩種不同的DNA分子進行體外重組，并且在大腸桿菌中表達以來，基因工程技術發(fā)展飛速，該技術正在極大地改變著地球生物固有的進化進程。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前全球已有60多種轉(zhuǎn)基因園藝植物和大田作物相繼問世，其中轉(zhuǎn)基因工程技術在棉花品種改良中的應用，成效卓著。自從1983年人類首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草、馬鈴薯以來，植物重組DNA技術在基礎研究和應用開發(fā)中獲得了顯著進展，培育成功一批具有抗蟲、抗病、耐除草劑和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等外源優(yōu)異性狀的農(nóng)作物新品種，對農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)方式和經(jīng)濟效益產(chǎn)生了深刻影響。棉花是利用轉(zhuǎn)基因技術進行遺傳改良最為成功的作物之一，僅我國自主研制的,CryA+CPTI雙價抗蟲等基因就已被轉(zhuǎn)育到41個棉花品種中。美國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉大田種植已超過其棉田總面積的70%，澳大利亞和中國超過30%，全球轉(zhuǎn)基因棉花種植面積達到680萬公頃，占世界棉花種植面積的20%。轉(zhuǎn)基因技術棉花轉(zhuǎn)基因技術是指將外源DNA通過物理、化學或生物學方法導入棉花細胞并得到整合和表達的過程。在棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系中，主要有農(nóng)桿菌介導、花粉管通道和基因槍3種轉(zhuǎn)化方法。本研究擬對.種方法的主要技術特點及研究和應用動態(tài)進行綜述，旨為棉花分子育種提供參考。農(nóng)桿菌介導法1.1.1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術的理論基礎與棉花遺傳轉(zhuǎn)化有關的根癌農(nóng)桿菌是一種土壤習居菌，在自然狀態(tài)下能感染棉花等大多數(shù)雙子葉植物營養(yǎng)器官的傷口，導致冠癭瘤的發(fā)生。根癌農(nóng)桿菌含有一種Ti質(zhì)粒，侵染時通過棉花器官的傷口進入寄主組織，但其本身不進入寄主植物細胞，只把Ti質(zhì)粒的T-DNA片斷導入棉花的基因組中并得以表達，且外源DNA表達通常表現(xiàn)出典型的孟德爾遺傳規(guī)律。由于Ti質(zhì)粒本身能插入大到50kb的外源DNA，因此利用此轉(zhuǎn)化載體，將Ti質(zhì)粒上致瘤基因切除，代之以有益的外源DNA序列，并插入由真核型啟動子和細菌抗生素抗性選擇標記基因或報告基因組成的嵌合基因，將改造后的農(nóng)桿菌侵染棉花器官或細胞，在加有相應選擇因子的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化再生植株，進而可得到轉(zhuǎn)基因植株?；ǚ酃芡ǖ婪?.2.1花粉管通道轉(zhuǎn)化技術的理論基礎從整體上說，遠緣親本間的染色體結(jié)構是不親和的。但從進化的角度來看，任何生物DNA均由4種核苷酸組成，這樣就可能在順序上出現(xiàn)不同程度的相同排列，因此部分基因的結(jié)構有可能保持一定的親合性。雖然進化中同時存在著相當強的保守性，但生物的主要基礎代謝，如糖、氨基酸、能量代謝、蛋白質(zhì)和核酸的生物合成與分解等都是共有的（如有90%以上的已知酶在各種生物中都是共有的）。當外源花粉的基因組進入母體（受體）后，大部分片段被分解，僥幸保存下來的某些DNA片段有可能整合進入受體的染色體，在子代中表達典型的或更多是非典型的遺傳變異。外源DNA片段進入受體，整合是隨機的，可能整合到結(jié)構基因中，也可能通過調(diào)控基因或重復序列以調(diào)控方式發(fā)揮作用。1.2.2花粉管通道法轉(zhuǎn)化的棉花植株后代遺傳特點性狀變異廣泛，類型豐富，穩(wěn)定快，變異頻率較高。研究表明，由外源DNA直接導入所引起的性狀變異，涉及棉花的各類質(zhì)量和數(shù)量性狀，包括植株形態(tài)、生長發(fā)育、生理生化、抗性、產(chǎn)量構成等各個方面，一般變異性狀布3或D4代就能夠穩(wěn)定，大大縮短了育種進程。同時，總DNA導入引起的變異在表型、生理生化產(chǎn)物及DNA分子標記的3個層次上與常規(guī)育種產(chǎn)生的變異極為相似。通常轉(zhuǎn)化率為1%-10%。遺傳較為復雜。有些變異既不是供體性狀也不是受體原有性狀，后代的分離現(xiàn)象，有的符合孟德爾規(guī)律，但大多數(shù)是不符和的。1.2.3在棉花上的研究現(xiàn)狀及應用在應用方面，1981年黃駿麒等應用花粉管通道法成功地將抗病基因?qū)氲礁弋a(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、感病的棉花品種中，獲得耐黃萎病、抗枯萎病的棉裕118新品種。謝道昕等通過花粉管途徑將蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因（Bt基因）導入棉花，獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，并首次獲得轉(zhuǎn)基因的分子證據(jù)。之后，我國學者通過此方法陸續(xù)將Bt,Bt+CpTI,sGNA等基因?qū)胫袊髟悦藁ㄆ贩N中，目前已育成許多轉(zhuǎn)基因品種（系）。1.3基因槍法1.3.1基因槍轉(zhuǎn)化技術的理論基礎基因槍法（Particlegun），又稱微彈轟擊法，是依賴高速度的金屬微粒將外源基因引入活細胞的一種轉(zhuǎn)化技術。其基本原理是將外源DNA包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓作用下將微粒高速射入受體組織或細胞，微粒上的外源DNA進入細胞后，整合到植物基因組上，并得到表達，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。因為微粒的體積非常小，且射擊速度很快，所以外源基因進入細胞后仍能保持正常生物活性，被轟擊過的細胞或組織，雖含有顆粒，但仍能存活，發(fā)育不受太大的影響。1.3.2研究進展和應用基因槍轉(zhuǎn)化技術在棉花遺傳轉(zhuǎn)化中尚處于研究和起步階段John等第一次將此技術應用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化中，以胚性懸浮細胞系為受體進行轟擊，成功得到轉(zhuǎn)化植株；之后，McCabe等以莖尖分生組織為受體、郝秀英等以棉花下胚軸為受體、Rajasekaran等用胚性細胞懸浮系為受體均獲得了抗性轉(zhuǎn)化植株。謝迎秋對葉肉細胞進行轟擊研究棉花曲葉病毒反式作用因子Ac2的功能等。到目前，使用基因槍進行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化不過十幾年的時間，還有許多問題需要進一步研究。棉花基因槍轉(zhuǎn)化效率一般為0.001%-0.01%，因此，如何提高轉(zhuǎn)化率是有待解決的核心問題，國內(nèi)外的研究主要圍繞轉(zhuǎn)化前受體材料類型、滲透處理、多莖尖誘導及劈開分生組織暴露出敏感層等，研究和提高外植體的接受能力及外植體的數(shù)量，同時研究轟擊后細胞的恢復調(diào)整和梯度篩選強度等，以提高植株再生效率，優(yōu)化轉(zhuǎn)化技術體系，進而提高基因槍轉(zhuǎn)化率。1.4其他方法獲得轉(zhuǎn)基因棉花的方法還有很多，例如PEG介導法、脂質(zhì)體介導法、超聲波介導法、電激法、注射法、浸泡法等。轉(zhuǎn)基因棉花育種成就2.1抗蟲基因工程目前應用于棉花的抗蟲基因主要有蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素蛋白（Bt基因）、從植物中分離的昆蟲蛋白酶抑制劑（PI基因）和植物凝集素基因（lectin）。2.1.1轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉美國Agracetus公司1987年首次報道已獲得外源標記基因的珂字312遺傳工程棉花，不久該公司利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導法在世界上首次將蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因轉(zhuǎn)入商品棉。連續(xù)兩年的室內(nèi)和罩籠鑒定表明，轉(zhuǎn)基因棉花抗鱗翅目幼蟲，抗性特征穩(wěn)定，并可通過種子遺傳。但大田抗棉鈴蟲試驗效果不理想,主要原因是轉(zhuǎn)基因棉花中毒蛋白含量不夠1990年Monsanto公司將改造的Bt基因?qū)朊藁ǎ瑓⒓哟筇镌囼灥霓D(zhuǎn)基因材料中Bt基因表達產(chǎn)物的含量提高了100倍。1996年Monsanto公司與岱字棉公司合作，開展轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的選育和品種的商業(yè)化工作，并迅速將抗蟲棉種子銷售市場拓展到中國的河北、安徽、山東等省，目前抗蟲棉品種33B占據(jù)中國抗蟲性市場的半壁江山，估計在黃河流域的推廣面積已累計達13313萬hm2。Monsanto公司最近又育成具有2個Bt基因的棉花新品系一BGII。田間試驗表明新品系對棉鈴蟲，尺、甜菜夜蛾都有很好的抗性。另外，澳大利亞、前蘇聯(lián)、法國也培育出抗蟲棉品種。國內(nèi)棉花抗蟲基因工程起步較晚，但發(fā)展迅速。中國農(nóng)科院生物技術研究所、江蘇省農(nóng)科院經(jīng)濟所、山西省農(nóng)科院棉花所、中國農(nóng)科院棉花所等先后報道利用基因工程技術和常規(guī)育種手段相結(jié)合的方式，獲得了一系列轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉品系。目前已通過審定的國產(chǎn)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉品種有：GK-1、GK12、GK19、GK22、中38、南抗3號等。2.1.2轉(zhuǎn)Bt+CPTI雙價抗蟲棉目前國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因抗蟲棉普遍存在抗蟲性的遺傳穩(wěn)定性問題。轉(zhuǎn)Bt基因單價抗蟲棉只能產(chǎn)生一種殺蟲蛋白，主要對棉鈴蟲等鱗翅目害蟲有抗性。但有關研究表明，轉(zhuǎn)單一Bt殺蟲基因抗蟲棉種植若十年后，棉鈴蟲有可能產(chǎn)生抗性。Bt抗蟲棉抗蟲譜較窄，抗蟲范圍局限性較大，Bt抗蟲棉主要只對鱗翅目中的一些害蟲具有抗性。其次，Bt抗蟲棉的抗蟲性表達具有時空性，隨著葉子的老化，抗蟲性下降。目前轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉品種的遺傳基礎比較薄弱，一旦抗性崩潰，其后果將是慘重的。與單價抗蟲基因相比，雙價抗蟲基因可成倍延長品種的抗性。據(jù)2001年信息，由中國農(nóng)科院生物技術研究所構建Bt+CPTI雙價抗蟲基因，利用花粉管通道法導入受體品種石遠321,成功地培育出SGK321雙價基因抗蟲棉，并于1999年6月通過農(nóng)業(yè)部生物基因安全性評價，獲準在4個省份進行商品化生產(chǎn)SGK321雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉同現(xiàn)有的單價抗蟲棉相比，最大的優(yōu)點在于其具有更穩(wěn)定持久的抗蟲性。2.1.3蛋白酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)化目前應用于棉花的PI基因主要是豇豆胰蛋白酶抑制劑（Cp—Ti基因）和慈菇蛋白質(zhì)酶抑制劑（API基因）。分別將CpTi基因和修飾過的CpTi基凼導人棉花，獲褥的轉(zhuǎn)基因植株后代對抗棉鈴蟲具有明顯的抗性。API對多種蛋白酶具有抑制活性，其抗蟲能力優(yōu)于CpTi基因。2.1.4植物凝集素基因的轉(zhuǎn)化棉蚜是棉花的另一個主要害蟲，隨著抗棉鈴蟲轉(zhuǎn)基因棉花的普遍種植，棉蚜的危害逐漸加重。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術獲得抗蚜棉花品種已成為棉花抗蟲育種的新課題。植物凝集素是一類具有特異糖結(jié)合的活性蛋白，有些具有抗蟲性，特別是對蚜蟲等同翅目害蟲有極強的抗殺作用。將來源于小麥胚芽凝集素基因?qū)岁懙孛藓螅D(zhuǎn)基因T。代能顯著抑制棉鈴幼蟲和棉蚜的生長發(fā)育；而將Bt+GNA雙價基因?qū)嗣藁ê螅@得的轉(zhuǎn)基因株系對棉鈴蟲和棉蚜有較好的抑制效果。抗除草劑棉花棉田雜草種類繁多，給棉花生產(chǎn)造成嚴重干擾，而由于棉花不含抗除草劑基因。所以把外源抗除草劑基因轉(zhuǎn)人棉花，使棉株對某種除草劑具有抗性，對棉花生產(chǎn)意義重大。棉花中成功應用的抗除草劑基因是:抗草甘膦(glyphosate基因、抗漠苯腈(bromoxyril)基因和2，4一D單氧化酶基因(tfdA)。2.2.1抗草甘麟基因的轉(zhuǎn)化1989年，Deaton等將編碼異構EPSP草甘膦合成酶基因(aroA)轉(zhuǎn)入棉花，選育出抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因棉花。經(jīng)過連續(xù)三代的研究，發(fā)現(xiàn)該基因以單拷貝方式整合到棉花基因組中，且遵循盂德爾的遺傳分離規(guī)律。隨后，Monsanto公司的Nida等也獲得了抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因棉花。而Keller等將來自鏈霉素的Bar基因分別導人棉花品種后，獲得了可抗高達15g-kg-1除草劑的Basta@轉(zhuǎn)基因株系。2.2.2轉(zhuǎn)2,4—D單氧化酶基因2,4一D是一種激素型除草劑，通過干擾植物細胞分裂的速率達到除草目的。2,4一D是一種非常穩(wěn)定的化臺物，但它能被微生物中的2,4—D單氧化酶(zfdA)所降解。棉花對2,4-D非常敏感，將微生物中分離出的tfdA基因轉(zhuǎn)入棉花后，可大大提高棉花對2,4—D的抗性。目前，國內(nèi)外均獲得了一些抗2,4-D的棉花品系。1992年，Bay-ley等g首先把tfdA基因?qū)嗣藁ㄖ?，獲得了能穩(wěn)定遺傳并表達的轉(zhuǎn)基因棒系。2.2.3轉(zhuǎn)澳苯睛水解酶基因1989年，F(xiàn)illatti等將編碼漠苯腈的水解酶基因BXN轉(zhuǎn)人棉花中，田問試驗表明轉(zhuǎn)基因植株仍能正常生長。棉花對除草劑咪唑啉酮也非常敏感。Grula等和Rajasekaran等分別將乙酰羥酸合酶AHAs基因和膦絲菌素蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶PAT基因?qū)腙懙孛拗?，分子檢測證實該基因已導人棉花基因組中并得到表達；抗性后代用平常使用5倍濃度的除草劑咪唑啉酮噴灑仍能正常生長?？钩輨┟藁ǖ倪x育成功并在生產(chǎn)上大面積應用，給棉花生產(chǎn)帶來一場新的變革，育成一系列轉(zhuǎn)抗除草荊基岡棉花新品種，并在牛產(chǎn)上大面積應用，可取得良好的生態(tài)和經(jīng)濟效益。2.3抗病基因工程棉花病害嚴重，尤其是黃萎病和枯萎病兩種土傳真菌性病害，根治非常困難，是棉花生產(chǎn)的主要障礙。目前，應用在棉花抗病基因丁程中的基因主要有幾丁質(zhì)酶(Chi)、6-1,3-葡聚糖酶(Glu)、葡萄糖氧化酶(GO)等外源抗病基因。2.3.1幾丁質(zhì)酶基因和爭1,3—葡聚糖酶基因幾丁質(zhì)酶(Chi)和0-1,3—葡聚糖酶(GIu)是植物防御體系中的兩種防衛(wèi)因子，兩者之問存在協(xié)同增效作用。為了提高棉花的抗枯黃萎病的能力，劉桂珍等和程紅梅等先后將構建的Chi和Glu嵌合雙價基因?qū)嗣藁ǎ堰x出對枯黃萎病抗性提高的轉(zhuǎn)基因棉花株系。吳家和等⑵］將維管束特異啟動子啟動的Chi和CaMV35S啟動的Glu嵌合基因?qū)岁懙孛奁贩N，獲得3個高抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因純合系。2.3.2葡萄糖氧化酶基因的應用葡萄糖氧化酶(GO)用于防治土傳性病害的主要機制是通過該酶催化8-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2。生成的H2O2可直接誘發(fā)植物的抗病反應或作為抗菌劑，也可以作力第二信使誘導植株系統(tǒng)抗性的形成。將GO基因?qū)朊藁ê?，轉(zhuǎn)基因株系對抗黃簍病的抗性明顯提高［28］；而劉慧君等如將G0基因?qū)烁胁∑贩N新陸早7號，獲得的轉(zhuǎn)GO基因棉對立枯病和枯萎病等苗期病害，以及炭疽病、黑果病、疫病等鈴期病害的抗性有明顯提高，并且轉(zhuǎn)GO基因棉株型變矮、果柄變長、單株成鈴數(shù)多和纖維品質(zhì)明顯提高等農(nóng)藝性狀變化。這表明GO基因是一種具有良好應用前景的廣譜性基因，對棉花黃萎病育種有著非常重要的意義。2.4抗逆境基因工程近年來，國內(nèi)外圍繞棉花抗鹽性、挽早衰等方面開展了一些研究，并取得了一定進展。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶如谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶的活性與逆境脅迫關系密切。Payton等將錳超氧化物歧化酶MnS0D基因?qū)嗣藁?，轉(zhuǎn)基因棉花能表達葉綠體定位的MnSOD.葉片中的SOD的活性增加了3倍，并且谷胱甘肽還原酶和抗壞血酸還原酶的活性也相應增加。沈法富等將抗鹽堿羅布麻DNA導入魯棉6號，育成了兩個耐鹽堿品系“91—11”和。91-15”，在含鹽量為0.51%的濱海鹽堿地種植，其皮棉產(chǎn)量分別比受體魯棉6號增產(chǎn)191.7%和237.8%。根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，是決定植物生長狀況和早衰與否的關鍵之一。2.5纖維品質(zhì)改良基因工程2.5.1增加纖維強度和長度轉(zhuǎn)動物角質(zhì)蛋白、蠶絲芯蛋白、兔角蛋自和蛛絲蛋白等基因棉的獲得不僅為棉花纖維品質(zhì)的基因工程改良奠定了理論基礎，還為棉花纖維品質(zhì)育種提供新的材料，其有重要的理論和實踐意