重組質(zhì)粒的構(gòu)建實驗流程—質(zhì)粒構(gòu)建基因提取—1基因提取—1、2、3PCR反應(yīng)擴增目的基因—PCR反應(yīng)擴增目的基因—4、3DNA片段回收—DNA片段回收—5、3重組質(zhì)粒檢測：（1）PCR(2)雙酶切—8、5測序重組質(zhì)粒檢測：（1）PCR(2)雙酶切—8、5測序重組質(zhì)粒提取—2、3菌種保藏—7目的片段與載體連接及轉(zhuǎn)化—6實驗操作LB培養(yǎng)基配置LB培養(yǎng)基用于一般細(xì)菌培養(yǎng)，特別用于分子生物學(xué)試驗中大腸桿菌的保存和培養(yǎng)。其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、維生素和生長因子，NaCl維持均衡的滲透壓，葡萄糖提供碳源，瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑?！驹噭恳鹊鞍纂耍═ryptone）、酵母提取物（YeastExtract）、NaCl、瓊脂（Agar）【實驗步驟】LB固體培養(yǎng)基配方（配置100ml培養(yǎng)基）胰蛋白胨（Tryptone）1g酵母提取物（YeastExtract）0.5gNaCl1g瓊脂（Agar）1.5g單蒸水100ml蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速，另外，稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品、或在稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一種藥品，瓶蓋也不要蓋錯。液體培養(yǎng)基除不加瓊脂外，其余同固體培養(yǎng)基一樣。3、包扎用報紙封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。滅菌將上述培養(yǎng)基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入4℃冰箱內(nèi)暫存。滅菌后，將錐形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。LB固體培養(yǎng)基倒板eq\o\ac(○,1)配置：如上述配方配置100ml的LB固體培養(yǎng)基。eq\o\ac(○,2)抗生素的加入：將凝固的培養(yǎng)基放入微波爐內(nèi)加熱至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培養(yǎng)基溫度降至55℃時（手可觸摸）加入抗生素，以免溫度過高導(dǎo)致抗生素失效，并充分搖勻。eq\o\ac(○,3)倒板：一般10ml倒1個板子，培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，打開蓋子，在紫外下照10—15min。eq\o\ac(○,4)保存:將培養(yǎng)皿倒置放于4℃保存，一個月內(nèi)使用。二、質(zhì)粒的提取（protocol）1、大腸桿菌的培養(yǎng)：從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至5ml的含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)?！咀ⅲ号囵B(yǎng)液不宜過量，過量時會因菌量太大而溶菌不充分，純化時會影響質(zhì)粒的純度?！?、5ml菌液倒入5ml離心管中，10,000xg，1min離心，棄上清。（實驗室用的離心機轉(zhuǎn)速達(dá)不到，故將其調(diào)到最大轉(zhuǎn)速12,000rmp，離心2min）【注：rmp（轉(zhuǎn)速）與rcf=×g（相對離心力）,RPM只是一個習(xí)慣用法，g才是衡量轉(zhuǎn)速的通用標(biāo)準(zhǔn)：不同的轉(zhuǎn)子，RPM是不能通用的，g值則是通用的，也就是說，只要你在不同的離心機上用相同的g，他們的離心效果原則上是一樣?！?、加入250ulSolutionⅠ（使用前加入RNaseA1，冰箱4℃冷藏），充分懸浮細(xì)菌沉淀?！咀ⅲ鹤⒁獠灰獨埩艏?xì)小菌塊，可以使用振蕩器Vortex等劇烈震蕩使菌體充分懸浮。】4、加入250ulSolutionⅡ【裂解細(xì)胞】（提前放入37℃孵育箱內(nèi)預(yù)熱）輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5—6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液?！咀ⅲ捍瞬襟E不宜超過5min】5、加入350ulSolutionⅢ【變性蛋白】，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合5—6次，直至形成緊實凝集塊。6、將上面液體倒入1.5ml的EP管中，13,000xg，10min離心。7、將上述離心得到的液體倒入柱內(nèi)，10,000xg，1min離心，棄液體。8、加入500ulbufferHB，10,000xg，1min離心，棄液體。9、加入700ulDNAwashbuffer（提前加入指定體積的100%乙醇），10,000xg，1min離心，棄液體。（重復(fù)一次）10、空離，13,000xg，2min離心。11、將離心柱放入1.5mlEP管內(nèi)，置于孵育箱內(nèi)3min烘干。12、加入60ulddH2O（提前在60℃水浴箱內(nèi)預(yù)熱），60℃搖2min。13、13,000xg，1min離心，得液體。14、測濃度。15、DNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測?！咀ⅲ禾岷玫馁|(zhì)粒需標(biāo)明時間、名稱等，-20℃保存?！咳傊悄z電泳【試劑】瓊脂糖（Agarose），1xTAE電泳緩沖液，染料（SyBRSafeDNAGelStain）,DL2000DNAMarker,10xLoadingBuffer【實驗步驟】1、配置50ml（大樣）、25ml（小樣），1.5%的瓊脂糖凝膠。稱取50x1.5%=0.75g瓊脂糖粉末于錐形瓶中，加入50ml1xTAE緩沖液，染料2ul（邊加染料邊倒TAE緩沖液于裝有瓊脂糖的錐形瓶中），封口。2、放在微波爐中加熱，沸騰2次，直到看不到油滴，形成均一的溶液。（一般中低檔，5min）3、插入梳子，倒入制膠槽中。4、放在抽屜里室溫、避光靜置20min。5、按下表加樣。eq\o\ac(○,1)適用于檢測DNA（小孔）：Marker（DL2000）樣品3ul 質(zhì)粒（DNA）10xLoadingBuffer1xTAE3ul1ul6ul

eq\o\ac(○,2)適合回收DNA(大孔)Marker（DL2000）樣品6ul 質(zhì)粒（DNA）10xLoadingBuffer20ul2.2ul6、120V，電泳25min左右。7、檢測：將凝膠板放入檢測儀中檢測。新建→選染料（SyBRsafe）→選顏色（SyBRGreen）→勾除高亮選項→檢測→文本注釋(字體14，顏色白色)→保存（酶切后的質(zhì)粒會出現(xiàn)兩條色帶，上面的一條是載體較暗，下面的一條是目的質(zhì)粒較亮，根據(jù)Marker顯示，證明是否是所需質(zhì)粒）【注】1、當(dāng)加入濃度的樣品量小于5ul時，10xLoadingBuffer均加1ul。2、電泳的加樣空寬度小于6mm時，每次取5ul制品電泳便可得到清晰條帶，如果加樣空增寬，需適當(dāng)增加Marker制品的加樣量。3、對DNA電泳而言，瓊脂糖的純度對DNA條帶的清晰度影響很大。4、進行瓊脂糖凝膠電泳時，瓊脂糖的濃度與DNA片段的分離性能關(guān)系密切。瓊脂糖的濃度越大，對短片段的分離性能越好，反之，瓊脂糖濃度越小，越有利于長片段DNA的分離。5、當(dāng)電泳后片段需回收時，選用大孔膠，當(dāng)電泳只起檢測作用時，選用小孔膠。6、若電泳產(chǎn)物需要回收，則需換新的緩沖液。7、實驗室有兩種常用的Marker分別為DL2000DNAMarker和λ-EcoT14digestDNAMarker。瓊脂糖電泳圖像示意圖如下：四、PCR【試劑】滅菌水、10xbuffer、混合的寡核苷酸（dNTPS）、引物（上、下）TaqDNA聚合酶、模板DNA（質(zhì)粒）【操作步驟】加樣前應(yīng)先打開PCR儀預(yù)熱。1、在0.5mlPCR管中加入依次下列試劑：eq\o\ac(○,1)25ul體系（EGFP擴增）：滅菌水：9.5ulLA混合物：12.5上引物：1ul下引物：1ul模板DNA（PCDHA）：1ul總體積：25.0ul2、將上述PCR反應(yīng)混合物放入PCR儀中。3、設(shè)定程序進行擴增：94℃變性5min后，開始以下循環(huán)94℃變性-----------------------------------------30s55℃退火（退火溫度不固定，根據(jù)引物進行調(diào)整）-----1min72℃延伸-----30s（延伸時間根據(jù)目的片段的長度進行調(diào)整）共30個循環(huán)最后循環(huán)結(jié)束后72℃反應(yīng)7min，4℃冷卻。4、PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測?！咀ⅰ?、當(dāng)PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物目的片段還需要進行后續(xù)操作時，選用LATaq酶；當(dāng)PCR反應(yīng)用于檢測時選用EXTaq酶。2、buffer的選擇應(yīng)與酶的選擇相對應(yīng)，例如：LATaq酶對應(yīng)的buffer為10xLAPCRBuffer。3、在PCR小管中加樣時，應(yīng)先將各試劑加到管壁上，最后混勻。這樣既節(jié)省時間，又節(jié)省槍頭。五、PCR產(chǎn)物的回收純化1、將PCR產(chǎn)物稍微離心片刻。2、將PCR擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中，然后加入4-5倍體積的BufferCP,若PCR產(chǎn)物<200bp則加入6倍體積的BufferCP。3、充分振蕩混合。4、然后轉(zhuǎn)移至DNA離心柱中，10,000xg離心1min，倒回重復(fù)一次，棄液體。5、加入700ul的DNAWashBuffer，10,000xg離心1min，棄液體。6、空離，13,000xg，2min離心。7、將離心柱放入1.5mlEP管內(nèi)，吹風(fēng)吹干。8、加入15-30ulddH2O（提前在60℃水浴箱內(nèi)預(yù)熱），60℃搖2min。9、13,000xg，1min離心，得液體。六、與T載體連接10ul體系2xRapidLigationBuffer，T4DNALigase5ulPGEM-TEasyVector（50ng）1ulPCRproduct（150ng）150/CulT4DNALigase1ulWater3-150/Cul總體系10ul放入4℃冰箱內(nèi)過夜。

七、DNA片段的回收純化【實驗步驟】1、實驗前將水浴鍋調(diào)到55℃-60℃，將滅菌水60℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2、使用TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。3、在紫外燈下切出還有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA的回收率。（注：切膠時請注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防DNA損傷，先切后驗證。）4、切碎膠塊。5、向膠塊中加入膠塊融化液Bindingbuffer500ul。6、均勻混合后55℃-60℃加熱融化膠塊7min，此時應(yīng)間斷振蕩混合。（注：膠塊一定要充分融化，否則將會影響DNA的回收率。）7、將上述膠塊融化液倒入柱子內(nèi)，10,000xg1min離心，倒回，重復(fù)一次。8、加入300ulBindingbuffer，10,000xg1min離心，棄濾液。9、加入700ulDNAwashbuffer，10,000xg1min離心，棄濾液。10、空離，13,000xg，2min離心。11、將離心柱放入1.5mlEP管內(nèi)，吹風(fēng)吹干。12、加入30ulddH2O（提前在60℃水浴箱內(nèi)預(yù)熱），60℃搖2min。13、13,000xg，1min離心，得液體。八、目的片段與載體的連接及轉(zhuǎn)化【試劑】PMD-18載體、目的片段、SolutionⅠ、感受態(tài)細(xì)胞、LB液體培養(yǎng)基（加氨芐青霉素抗體AMP）、含AMP的LB固體培養(yǎng)基【實驗步驟】1、連接eq\o\ac(○,1)、實驗前水浴準(zhǔn)備。eq\o\ac(○,2)、在PCR管中加入：PMD-18載體1ul目的片段4ul總體積5uleq\o\ac(○,3)、再加入5ul的SolutionⅠeq\o\ac(○,4)、16℃，連接90min2、轉(zhuǎn)化eq\o\ac(○,1)、全量10ul加入至感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置40min。eq\o\ac(○,2)、42℃水浴鍋內(nèi)熱激90s（讓質(zhì)粒進入感受態(tài)細(xì)胞）。eq\o\ac(○,3)、取出冰上放置5min（讓感受態(tài)細(xì)胞關(guān)閉）。eq\o\ac(○,4)、加入200ulLB液體培養(yǎng)基（無抗體AMP），37℃搖床培養(yǎng)1h。3、涂板將上述培養(yǎng)液涂布在含AMP的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)。（3ml培養(yǎng)基中加入3ulAMP）4、挑菌第二天晚上五點左右挑菌，在5mlLB液體培養(yǎng)基（加5ulAMP）中搖床培養(yǎng)，37℃過夜。（5mlLB培養(yǎng)菌+5ulAMP+用槍頭挑菌，槍頭可打入培養(yǎng)瓶中）5、第二天提取質(zhì)粒。或6、保藏eq\o\ac(○,1)、實驗前超凈臺滅菌。eq\o\ac(○,2)、將500ul50%的甘油與500ul菌