免疫磁珠分離技術(shù)（IMB）

及在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用

段旭昌副教授西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2013910提綱磁性微球磁性微球結(jié)構(gòu)、分類及特點(diǎn)磁性微球的制備磁性微球分離技術(shù)免疫磁株免疫磁珠結(jié)構(gòu)與性質(zhì)免疫磁株的特點(diǎn)免疫磁珠的分類免疫磁珠的制備免疫磁珠分離技術(shù)免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用免疫磁珠在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用免疫磁珠與其它檢測(cè)手段的聯(lián)用免疫磁珠技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展望一磁性微球是通過一定方法將磁性無機(jī)粒子與有機(jī)高分子結(jié)合形成的具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的體積在幾納米到幾十微米之間的復(fù)合微球。高分子磁性微球表面具有眾多表面功能基團(tuán)，同時(shí)具有磁響應(yīng)性，在外加磁場(chǎng)作用下具有磁導(dǎo)向功能。目前已廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分離工程等領(lǐng)域。二磁性微球結(jié)構(gòu)、分類及特點(diǎn)磁性核材料多為Fe、Co、Pt、Ni等金屬及其氧化物。如Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O3（Me=Co、Mn、Ni）、BaFe12O19、鐵鈷合金（Fe-Co和Ni-Fe）。最常用的是Fe、Fe2O3、Fe3O4。其中Fe3O4應(yīng)用最多。構(gòu)成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物質(zhì)。天然高分子有明膠、球蛋白、牛血清白蛋白、聚賴氨酸、淀粉和多種聚糖如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、殼聚糖、果膠等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺類、聚苯胺及硅烷等。這些材料可單獨(dú)用，也可復(fù)合使用。磁性微球表面可根據(jù)需要賦予不同的功能基團(tuán)(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—環(huán)氧基、—CHCl等)，使其表現(xiàn)具有疏水-親水、非極性-極性、帶正電荷-帶負(fù)電荷等不同物理性質(zhì)。同時(shí)具有磁響應(yīng)性，在外磁場(chǎng)作用下具有磁導(dǎo)向性。導(dǎo)電聚合磁微球聚合磁微球?qū)Υ判晕⑶虻囊螅毫骄鶆?、大小合適、比表面積大、吸附力強(qiáng)、具有強(qiáng)的超順磁性、懸浮均勻穩(wěn)定性好、不易聚集沉淀、表面具有多種活性基團(tuán)、理化性質(zhì)穩(wěn)定、具有較好生物相容性、對(duì)細(xì)胞、機(jī)體、活性物質(zhì)損傷小。由于環(huán)氧基、氯甲基功能基團(tuán)非?；钴S，不需連接其他活性基團(tuán)即可與生物配基（如抗體、抗原等）偶聯(lián)，及其他基團(tuán)的微型磁珠在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用較為廣泛。三磁性微球的制備

磁性微球制備方法：共沉淀法、懸浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法等。1.共沉淀法

金屬離子在堿性條件下與高分子共沉淀，一步反應(yīng)生成磁性高分子微球的方法。2Fe3++Fe2++8OH→Fe3O4+4H2OPich[等先通過單體聚合反應(yīng)得到PS-AAEM顆粒分散劑，再把配制好的Fe3+、Fe2+溶液加入聚苯乙烯（PS）-乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯（AAEM）顆粒的分散劑中，然后滴加NH3·H2O。Fe3O4粒子在PS-AAEM表面沉積，制得PS-AAEM為核心、Fe3O4粒子為殼層的磁性微球。微球的磁性能通過改變FeCl2和FeCl3的濃度或改變PS-AAEM核心的尺寸來控制。Xia等把一定配比的FeCl2、FeCl3與葡聚糖（dextranT-10）共混，然后滴加NH3·H2O，在超聲連續(xù)作用下水浴加熱，制得以Fe3O4為核、dextran為殼的磁性微球。楊玉東等把一定配比的FeCl3·6H2O、FeCl2·6H2O與配體（如二亞乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二氨四乙酸（EDTA）等）組成的混合液體加入到75℃的葡聚糖T-10溶液中，并快速滴加NH3·H2O，制備了葡聚糖為殼、氧化鐵為核的磁性微球。2聚合法制備磁性微球過程異相聚合法包括分散聚合、乳液聚合、懸浮液聚合三種。該法是將磁性粒子用表面改性劑、偶聯(lián)劑、引發(fā)劑等處理后分散到含有聚合物單體的溶劑中進(jìn)行聚合反應(yīng)。通常以磁性粒子為活性中心進(jìn)行單體聚合。四磁性微球分離技術(shù)MACS(MagneticActivatedCellSorting)

是將免疫學(xué)+細(xì)胞生物學(xué)+磁力學(xué)結(jié)合為一體，利用磁性微球表面功能基團(tuán)的專一親和特性或多孔吸附特性吸附特定組分，然后用外力磁場(chǎng)作用將吸附了特定物質(zhì)的磁珠加以分離，再經(jīng)過洗脫磁珠上吸附的目標(biāo)物質(zhì)的一種新型分離技術(shù)，具有廣泛的用途。

幾種DNA

分離方法的比較ComparationofseveralDNAextractionmethods方法

傳統(tǒng)法鰲合樹脂法玻璃粉法磁珠法免疫親和法DNA提取酚/氯仿等溶劑抽提Chelex100樹脂吸附玻璃粉吸附離心分離磁珠吸附磁場(chǎng)分離抗原抗體反應(yīng)磁場(chǎng)分離適用范圍大多數(shù)標(biāo)本DNA提取純化培養(yǎng)及各種臨床標(biāo)本土壤標(biāo)本冰凍、陳舊組織冰凍、陳舊組織，樣本含量很少的標(biāo)本方法評(píng)價(jià)DNA純度高、含量多，但較費(fèi)時(shí)，步驟繁瑣，用有機(jī)溶劑，有損操作者健康?？捎糜谂囵B(yǎng)標(biāo)本和各種臨床標(biāo)本細(xì)菌及部分病毒核酸的提取。方法簡便，可用于土壤中細(xì)菌芽孢DNA的提取，不能徹底除去PCR抑制劑。簡單、快速，整個(gè)過程不到2h，可獲得較純DNA。適于少量樣本。DNA純度高，含量多，適于樣本含量少標(biāo)本，單克隆抗體的制備是關(guān)鍵。五免免疫磁磁珠免疫磁磁珠（（IMB）也稱稱免疫疫磁性性微球球，是是在磁磁性微微球表表面偶偶聯(lián)上上免疫疫配基基的一一種磁磁性微微球，，是將將磁性性微球球技術(shù)術(shù)和免免疫學(xué)學(xué)相結(jié)結(jié)合的的特殊殊磁性性微球球。六免免疫磁磁珠的的結(jié)構(gòu)構(gòu)與性性質(zhì)免疫磁磁珠核核心為為順磁磁性粒粒子，，核心心外層層包裹裹一層層高分分子材材料，，最最外層層是免免疫配配基。。免疫配配基免疫配配基通通過生生物高高分子子的功功能基基團(tuán)結(jié)結(jié)合到到磁性性載體體微球球上形形成免免疫磁磁珠。。由于于載體體微球球制備備材料料和方方法不不同，，其表表現(xiàn)出出的物物理性性質(zhì)也也不同同，從從而而可結(jié)結(jié)合不不同的的免疫疫配基基，如如抗抗原、、抗體體、凝凝集素素、DNA和RNA等。配配基必必須具具有生生物專專一性性的特特點(diǎn)，，而而且載載體微微球與與配基基結(jié)合合要不不影響響或改改變配配基原原有的的生物物學(xué)特特性，，保保證磁磁珠的的特殊殊識(shí)別別功能能。免疫磁磁珠的的性質(zhì)質(zhì)具有均均勻性性、超超順磁磁性及及保護(hù)護(hù)性外外殼，，由磁磁性載載體微微球和和免疫疫配基基結(jié)合合而成成，表表面具具有專專一親親和性性和吸吸附作作用。。免疫磁磁珠大大小和和形狀狀具有有均一一性，，可可使靶靶物質(zhì)質(zhì)迅速速有效效地結(jié)結(jié)合到到磁珠珠上，，可使使新生生成復(fù)復(fù)合物物在磁磁場(chǎng)中中具有有相同同磁響響應(yīng)性性，且且行為為一致致。磁珠球球形結(jié)結(jié)構(gòu)可可消除除與不不規(guī)則則形狀狀粒子子間的的非特特異性性結(jié)合合，順順磁性性可使使磁珠珠置于于磁場(chǎng)場(chǎng)時(shí)顯顯示其其磁性性，并并做定定向移移動(dòng)，，從從磁場(chǎng)場(chǎng)移出出時(shí)磁磁性消消除，，磁磁珠分分散，，可可方便便地進(jìn)進(jìn)行分分離和和磁性性導(dǎo)向向。保護(hù)性性殼可可防止止磁性性內(nèi)核核漏出出或被被載液液腐蝕蝕；免疫配配基可可專一一性結(jié)結(jié)合反反應(yīng)體體系中中相應(yīng)應(yīng)的抗抗原、、抗體體、核核酸等等生物物活性性物質(zhì)質(zhì)。七免免疫磁磁株的的特點(diǎn)點(diǎn)磁性微微球與與免疫疫配基基結(jié)合合牢固固。不影響響或改改變免免疫配配基原原有的的生物物特性性和特特異性性。免疫微微球的的識(shí)別別專一一性。。在磁場(chǎng)場(chǎng)中具具有順順磁性性，離離開磁磁場(chǎng)磁磁性消消失，，易于于分散散。由于聚聚苯乙乙烯磁磁性微微球強(qiáng)強(qiáng)度高高、表表面易易進(jìn)行行化學(xué)學(xué)維修修飾，，是比比較理理性的的制造造免疫疫磁珠珠的材材料。。八免免疫磁磁珠的的分類類根據(jù)磁磁珠在在磁場(chǎng)場(chǎng)中受受力大大小及及磁珠珠體積積，分分為小小磁珠珠和大大磁珠珠。大磁珠珠：1-5um，粒徑徑較大大、懸懸浮穩(wěn)穩(wěn)定性性差、、易沉沉淀、、比表表面積積小、、吸附附能力力低、、吸附附活性性配基基少、、對(duì)細(xì)細(xì)胞影影響大大，特特別是是陽性性分選選時(shí)需需將磁磁珠與與細(xì)胞胞解離離后方方可進(jìn)進(jìn)行下下一步步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)。但但磁力力強(qiáng)，，無需需特殊殊分離離柱即即可實(shí)實(shí)現(xiàn)樣樣品分分離，，分離離速度度快、、過程程簡單單、成成本低低。小磁珠珠：50nm以下，，粒徑徑較小小、懸懸浮穩(wěn)穩(wěn)定、、比表表面積積大、、表面面吸附附活性性配基基多，，只有有細(xì)胞胞體積積的萬萬分之之一，，對(duì)細(xì)細(xì)胞表表型和和功能能影響響小，，不影影響細(xì)細(xì)胞的的后續(xù)續(xù)培養(yǎng)養(yǎng)。但但磁力力弱，，需特特殊分分離柱柱才能能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)樣品品分離離，分分離速速度慢慢，成成本高高九免免疫磁磁珠的的制備備免疫磁磁珠的的制備備是將將磁性性微球球和抗抗體等等配基基結(jié)合合而成成。磁磁性微微球與與抗體體的連連接方方式有有共價(jià)價(jià)結(jié)合合和吸吸附結(jié)結(jié)合兩兩種方方式。。共價(jià)結(jié)結(jié)合：：依靠磁磁珠表表面的的活性性基團(tuán)團(tuán)如-CHO、-COOH等與抗抗體Fab段上的的-NH2共價(jià)反反應(yīng)和和結(jié)合合吸附結(jié)結(jié)合：：依靠磁磁珠巨巨大的的比表表面與與抗體體見得得非特特異性性吸附附而結(jié)結(jié)合。。共價(jià)結(jié)結(jié)合的的牢固固度遠(yuǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大大于吸吸附結(jié)結(jié)合牢牢固度度。制備方方法：：先制備備磁性性微球球，然然后將將磁性性微球球分散散于抗抗體配配機(jī)溶溶液中中使磁磁珠與與抗體體充分分吸附附結(jié)合合，然然后分分離免免疫磁磁珠分分散于于緩沖沖溶液液中可可以使使用。。十免免疫磁磁珠分分離技技術(shù)免疫磁磁珠(immunomagneticbead,IMB)分離技技術(shù)：：是一種種以特特異的的抗原原抗體體反應(yīng)應(yīng)為基基礎(chǔ)的的免疫疫學(xué)磁磁性微微球檢檢測(cè)和和分離離技術(shù)術(shù)。它它是以以抗體體包被被的微微球磁磁珠為為載體體，通通過抗抗體與與反應(yīng)應(yīng)介質(zhì)質(zhì)中特特異性性抗原原結(jié)合合，形形成抗抗原—抗體復(fù)復(fù)合物物，此此復(fù)合合物在在外加加磁場(chǎng)場(chǎng)作用用下發(fā)發(fā)生定定向移移動(dòng)，，從而而達(dá)到到分離離抗原原的目目的。?；驹恚海捍判孕晕⑶蚯蚪?jīng)過過一定定處理理后,將抗體體結(jié)合合到磁磁珠上上,形成免免疫磁磁性微微球（（標(biāo)記記磁珠珠）,標(biāo)記磁磁珠的的抗體體與特特異性性抗原原結(jié)合合形成成抗原原—微球復(fù)復(fù)合物物,該復(fù)合合物在在磁場(chǎng)場(chǎng)中具具有與與其它它組分分不同同的磁磁響應(yīng)應(yīng)性,在磁力力作用用下,該復(fù)合合物發(fā)發(fā)生力力學(xué)移移動(dòng),從而達(dá)達(dá)到分分離抗抗原的的目的的。以細(xì)胞胞分離離為例例圖解解免疫疫磁珠珠技術(shù)術(shù)的原原理免疫磁磁珠標(biāo)標(biāo)記方方法1直接磁磁珠和和直接接標(biāo)記記法通過物物理吸吸附和和共價(jià)價(jià)鍵結(jié)結(jié)合直直接將將特意意性抗抗體與與磁珠珠耦合合，然然后再再與相相應(yīng)細(xì)細(xì)胞結(jié)結(jié)合，，形成成細(xì)胞胞-抗原-抗體-磁珠復(fù)復(fù)合物物，在在外磁磁場(chǎng)下下直接接分離離目的的細(xì)胞胞?？炜焖?、、簡單單、特特異性性和細(xì)細(xì)胞得得率高高，靈靈敏度度低，，需制制備相相應(yīng)的的偶聯(lián)聯(lián)抗體體磁珠珠。2簡介磁磁珠和和間接接標(biāo)記記法使用anti-lg等與磁磁珠偶偶聯(lián)，，通過過Anti-lg再使磁磁珠與與二抗抗體偶偶聯(lián)，，分離離細(xì)胞胞時(shí)，，先使使細(xì)胞胞與一一抗特特異性性結(jié)合合，然然后在在與一一抗標(biāo)標(biāo)記磁磁珠結(jié)結(jié)合，，形成成細(xì)胞胞-1抗-2抗-anti-lg-磁珠復(fù)合體體，在外磁磁場(chǎng)下分離離目的細(xì)胞胞的方法。。該法增加加了細(xì)胞的的洗滌步驟驟，特異性性也會(huì)降低低。該法一一般用于①①?zèng)]有直標(biāo)標(biāo)磁珠抗體體②需用幾幾種抗體去去除多種細(xì)細(xì)胞③目的的細(xì)胞上特特異性抗原原分子表達(dá)達(dá)水平低。。MACS微珠直標(biāo)微珠多選微珠間標(biāo)微珠免疫磁珠分分選方法陽性分選：：運(yùn)用特異性性抗體偶聯(lián)聯(lián)磁珠直接接從細(xì)胞混混合物中分分離目的細(xì)細(xì)胞的分選選方法稱為為positiveselection.陽性分選中中磁珠標(biāo)記記的細(xì)胞即即為目的細(xì)細(xì)胞。該法法簡單、快快速、細(xì)胞胞得率和純純度較高。。如采用anti-CD14磁珠分選CD14+巨噬細(xì)胞。。陰性分選：：用抗體偶聯(lián)聯(lián)磁珠去除除無關(guān)細(xì)胞胞，使目的的細(xì)胞得以以純化和分分離的分選選方法稱為為negativeselection.陰性分選中中磁珠標(biāo)記記的細(xì)胞為為非目的細(xì)細(xì)胞。如分分離CD4+T細(xì)胞時(shí)，由由于沒有專專用的CD4+T細(xì)胞分選磁磁珠，可通通過anti-CD8、anti-B220、anti-CD49b、anti-CD11b、anti-Ter119標(biāo)記磁珠去去除CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞、巨噬噬細(xì)胞、粒粒細(xì)胞等，，最終而獲獲得較純的的CD4+T細(xì)胞。因此此陰性分選選法適用于于：①從細(xì)細(xì)胞混合物物中去除某某種類型細(xì)細(xì)胞。如腫腫瘤細(xì)胞。。②缺乏針針對(duì)目的細(xì)細(xì)胞篩選的的特異性抗抗體磁珠時(shí)時(shí)。③抗體體和目的細(xì)細(xì)胞結(jié)合可可能誘導(dǎo)細(xì)細(xì)胞活化，，影響后續(xù)續(xù)細(xì)胞功能能分析時(shí)。。復(fù)合分選：：將陰性分選選和陽性分分選相結(jié)合合的分選方方法。當(dāng)目目的細(xì)胞含含量特別低低，無法直直接進(jìn)行陽陽性分選時(shí)時(shí)，可采用用陰性分選選發(fā)先出去去其他雜細(xì)細(xì)胞，當(dāng)目目的細(xì)胞富富集到一定定程度時(shí)在在采用陽性性分選發(fā)篩篩選目的細(xì)細(xì)胞。免疫磁珠與與細(xì)胞解離離1過夜培養(yǎng)法法：常用方法。。將結(jié)合磁磁珠細(xì)胞置置于10%胎牛血清培培養(yǎng)基中37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱箱中培養(yǎng)16-24h，磁珠可從從細(xì)胞上脫脫落，再通通過磁場(chǎng)除除去游離磁磁珠，即可可獲得裸細(xì)細(xì)胞。2anti-Fab抗體法：用anti-Fab抗體與磁珠珠偶聯(lián)抗體體競(jìng)爭(zhēng)目的的細(xì)胞，是是磁珠與目目的細(xì)胞解解離，用磁磁場(chǎng)除去游游離磁珠，，即可獲得得非標(biāo)記細(xì)細(xì)胞。3酶解法：通過木瓜蛋蛋白酶和唾唾液蛋白酶酶使磁珠與與細(xì)胞解離離，再通過過磁場(chǎng)除去去游離磁珠珠，獲得裸裸細(xì)胞。免疫磁珠分分離裝置免疫磁珠分分離裝置由由超強(qiáng)磁鐵鐵分離器和和分離柱組組成。磁鐵鐵和分離柱柱的型號(hào)多多樣，配合合0.5ml、1.5ml微量離心管管，15ml及50ml離心管或試試管，和96孔或384孔培養(yǎng)板中中樣品的分分離，以以滿足不同同試驗(yàn)要求求。十一免疫疫磁珠分離離技術(shù)的應(yīng)應(yīng)用分離抗原抗抗體分離蛋白和和多肽分離多糖物物質(zhì)分離DNA和RNA分離細(xì)胞和和病毒靶向釋藥系系統(tǒng)的載運(yùn)運(yùn)食品有害微微生物分析析與檢測(cè)磁珠法分離離抗體、抗抗原、蛋白白、多肽、、多糖、DNA、RNA操作過程示示意圖μMACSVitalvirusHiv分離試劑盒盒分離標(biāo)記記造血細(xì)胞胞表面的Hiv-1病毒CD44H異型細(xì)胞免疫磁珠標(biāo)標(biāo)記細(xì)胞示示意圖免疫磁珠分分離細(xì)胞及及病毒示意意圖十二免疫疫磁珠在食食品安全檢檢測(cè)中的應(yīng)應(yīng)用免疫磁珠對(duì)對(duì)病毒細(xì)胞胞具有特異異選擇性，，因此能用用于食品有有害微生物物的檢測(cè)。。免疫磁珠技技術(shù)與常規(guī)規(guī)檢驗(yàn)方法法相比具有有檢測(cè)迅速速、有選擇擇性分離目目的微生物物，有效減減少背景干干擾，提高高了精準(zhǔn)性性。同時(shí)還還能捕獲受受損傷靶細(xì)細(xì)菌。目前前，免疫磁磁珠技術(shù)已已廣泛用于于食品樣品品中致病微微生物的檢檢測(cè)。大腸桿菌O157的檢測(cè)傳統(tǒng)分離E.coliO157∶∶H7所采用的直直接分離法法存在著鑒鑒別力差、、抑制雜菌菌能力弱、、耗時(shí)長、、工作量大大等缺點(diǎn)。。采用免疫磁磁珠技術(shù)，，能夠快速速地從各種種食品樣品品中分離富富集E.coliO157∶∶H7，滿足流行行病學(xué)的研研究要求和和提高控制制力度?，F(xiàn)在這種免免疫磁珠的方法已經(jīng)經(jīng)被英國公公共健康服服務(wù)實(shí)驗(yàn)室室認(rèn)定為標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的分離離方法，我我國也已將將免疫磁珠珠法對(duì)大腸桿菌菌O157的檢測(cè)納入入國家標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)（GB/T4789.36-2008）和出入境檢驗(yàn)驗(yàn)檢疫行業(yè)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T1059.5-2006)。已有市售售的專用免免疫磁珠銷銷售。檢樣25g(mL)+225mL改良EC肉湯（mEC+n），均質(zhì)225mL免疫磁珠捕捕獲涂布CT-SMAC平板和改良良CHROMagarO157弧菌顯色瓊瓊脂平板挑取可疑菌菌落5個(gè)~10個(gè)，氧化酶酶陰性，革革蘭氏陰性性桿菌接種種TSIMUG-LST陽性GB/T4789.36-2008免疫磁珠捕捕獲法檢測(cè)測(cè)O157∶∶H7程序陰性血清學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)非O157細(xì)菌生化試驗(yàn)報(bào)告↓↓↓↓↓↓↓↓36±1oC18h~24h36±1oC36±1oC18h~24h18h~24h1增菌2免疫磁珠捕捕獲與分離離1.將Eppendorff管按樣品和和質(zhì)控菌株株進(jìn)行編號(hào)號(hào)，每個(gè)樣樣品使用1支Eppendorff管，然后插插人到磁板板架上。在在漩渦混合合器上輕輕輕振蕩E.coliO157免疫磁珠溶溶液后，用用開蓋器打打開每支Eppendo-rff管的蓋子，，每管加人人20μLE.coli0157免疫磁珠懸懸液。2.取mEC+n肉湯增菌培培養(yǎng)物1mL，加人到Eppendorff管中，蓋上上蓋子，然然后輕微振振蕩10s。每個(gè)樣品品更換1支加樣吸頭頭，質(zhì)控菌菌株必須與與樣品分開開進(jìn)行，避避免交叉污污染。具體操作3.結(jié)合:在18℃~30℃環(huán)境中，，將上述Eppendorff管連同磁板板架放在DynalMXl樣品混合器器上轉(zhuǎn)動(dòng)或或用手輕微微轉(zhuǎn)10min，使E.coliO157與免疫磁珠珠充分接觸觸。4.捕獲:將磁板插人人到磁板架架中濃縮磁磁珠。在3min內(nèi)不斷地傾傾斜磁板架架，確保懸懸液中與蓋蓋子上的免免疫磁珠全全部被收集集起來，此此時(shí)，在Eppendorff管壁中間明明顯可見圓圓形或橢圓圓形棕色聚聚集物。5.吸取上清液液:取1支無菌加長長吸管，從從免疫磁珠珠聚集物對(duì)對(duì)側(cè)深人液液面，輕輕輕吸走上清清液。當(dāng)吸吸到液面通通過免疫磁磁珠聚集物物時(shí)，應(yīng)放放慢速度，，以確保免免疫磁珠不不被吸走。。如吸取的的上清液內(nèi)內(nèi)含有磁珠珠，則應(yīng)將將其放回到到Eppendorff管中，并重重復(fù)4步驟。每個(gè)個(gè)樣品換用用1支無菌加長長吸管。6.洗滌:洗滌免疫疫磁珠混混合物，，重復(fù)上上述步驟驟4~6和4~5。7.免疫磁珠珠懸浮:將免疫磁磁珠重新新懸浮在在100μμLPBS-Tween20洗液中。。8.涂布平板板:用漩渦混混合器將將免疫磁磁珠混勻勻，用加加樣器各各取50μμL免疫磁珠珠懸液分分別轉(zhuǎn)移移至CT-SMAC平板和改改良CHROMagarO157弧菌顯色色瓊脂平平板一側(cè)側(cè)，再用用無菌涂涂布棒將將免疫磁磁珠涂布布平板的的一半，，用接種種環(huán)劃線線接種平平板的另另一半。。待瓊脂脂表面水水分完全全吸收后后，翻轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)平板，，于36℃士10℃培養(yǎng)18---24h。菌落識(shí)別別在CT-SMAC平板上，，典型菌菌落為不不發(fā)酵山山梨醇的的圓形、、光滑、、較小的的無色菌菌落，中中心呈現(xiàn)現(xiàn)較暗的的灰褐色色;發(fā)酵山梨梨醇的菌菌落為紅紅色;在改CHROMagarO157弧菌顯色色瓊脂平平板上為為圓形、、較小的的菌落，，中心呈呈淡紫色色一紫紅紅色，邊邊緣無色色或淺灰灰色。初步生化化試驗(yàn):在CT-SMAC和改良CHROMagarO157弧菌顯色色瓊脂平平板上挑挑取5個(gè)~10個(gè)典型或或可疑菌菌落，分分別接種種TSI瓊脂，同同時(shí)接種種MUG-LST肉湯，于于36℃士1℃培養(yǎng)18h~24

h。必要時(shí)時(shí)進(jìn)行氧氧化酶試試驗(yàn)和革革蘭氏染染色。在在TSI瓊脂中，，典型菌菌株為斜斜面與底底層均呈呈陽性反反應(yīng)呈黃黃色，產(chǎn)產(chǎn)氣或不不產(chǎn)氣，，不產(chǎn)生生硫化氫氫(H2S)。置MUG-LST肉湯管于長波波紫外燈下觀觀察，無熒光光產(chǎn)生者為陽陽性結(jié)果，有有熒光產(chǎn)生者者為陰性結(jié)果果;對(duì)分解乳糖且且無熒光的菌菌株，在營養(yǎng)養(yǎng)瓊脂平板上上分純，于36℃士1℃培養(yǎng)18

h~24

h，并進(jìn)行鑒定定。Fratamico等將兔抗E.coliO157∶H7多克隆抗體連連接到羊抗兔兔IgG包被的磁珠上上，從食物增增菌培養(yǎng)液中中分離O157∶H7菌株，再將帶帶菌的磁珠接接種到培養(yǎng)基基上，加入熒熒光素標(biāo)記的的O157∶H7抗血清，在熒熒光顯微鏡下下觀察，此法法敏感性為10cfu/mL增菌培養(yǎng)液。。Decory等建立了免疫疫磁珠-免疫脂質(zhì)體（（IMB/IL）熒光試驗(yàn)方方法，可在8h內(nèi)快速檢測(cè)出出多種液態(tài)樣樣品（水樣、、蘋果汁、蘋蘋果酒）中低低至1cfu/mL的E.coliO157∶H7，而傳統(tǒng)微生生物學(xué)方法不不能從陰性樣樣本中區(qū)分出出E.coliO157∶H7感染樣本。單核細(xì)胞增生生李斯特菌的的檢測(cè)傳統(tǒng)的單增李李斯特菌檢測(cè)測(cè)方法檢測(cè)周周期長，約5～14d，步驟繁瑣且且靈敏度低，，而IMB技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在在于在較低的的菌液濃度時(shí)時(shí)也可以通過過免疫磁珠的的富集作用進(jìn)進(jìn)行檢測(cè)，縮縮短了檢測(cè)時(shí)時(shí)間并進(jìn)一步步降低了單增增李斯特菌的的檢測(cè)限。2008年，我國將免免疫磁珠檢測(cè)測(cè)單核細(xì)胞增增生李斯特菌菌的方法納入入了出入境檢檢驗(yàn)檢疫行業(yè)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中(SN/T0184.3-2008)。檢樣25g(mL)對(duì)225mLFB1増菌液（30℃士1℃，24h士1h）1mL轉(zhuǎn)種10mLFB2増菌液（35℃，24h士1h）通過免疫磁珠珠捕獲李斯特特菌，然后再再用滅菌緩沖沖液洗滌用0.1mL的滅菌緩沖液液重新制成懸懸液吸取50uL免疫磁珠懸液液劃線于CHROMagar顯色培養(yǎng)基，，OXA/PALCAM瓊脂平板（35℃+1℃,24h~28h)各挑選5個(gè)典型菌落接種于TSA-YE瓊脂平板，純純培養(yǎng)鑒定和確認(rèn)試試驗(yàn)單增李斯特菌菌的檢測(cè)程序序與方法1樣品制備2增菌3免疫磁珠分離離((IMS）1)免疫捕獲混增菌培養(yǎng)液液.沉淀所有的粗粗糙食物殘?jiān)?從增菌培養(yǎng)液液中移取1mL上層液體(要盡可能避免免移取到食物物顆粒和脂肪肪顆粒)加人Eppendorf管中.加20μL準(zhǔn)備好的免疫疫磁珠。在旋旋渦混合器上上混合該懸液液。2）分離將Eppendorf管固定在磁架架的管孔中。。1800輕緩擺動(dòng)磁架架5次--6次,使免疫磁珠聚聚集到磁極。。小心地打開開磁架上的Eppendorf管管蓋,從磁極對(duì)面一一側(cè)慢慢吸出出液體，注意意不要接觸管管壁上的磁珠珠。每一個(gè)樣樣品換一次槍槍頭;加1

mI滅菌的PBS，并重新蓋好好蓋子.將磁極從支架架上移走，1800輕緩擺動(dòng)磁架架5次一6次,使管內(nèi)各成分分混合,后重新將磁極極放回到支架架上。重復(fù)該該清洗步驟幾幾次。將離心心管從磁性分分離器上移開開.并加100μL滅菌的PBS到管中，重懸懸磁珠。如實(shí)實(shí)驗(yàn)室沒有磁磁性分離器，，可以用手搖搖代替.4.分離培養(yǎng)1）分離培養(yǎng)吸取50μL免疫磁珠懸液液.加到顯色培養(yǎng)養(yǎng)基及任一選選擇性培養(yǎng)基基OXA、PALCAM瓊脂平板上.用無菌接種環(huán)環(huán)劃線.35℃士1℃培養(yǎng)22h-48h。2）篩選李斯特氏菌在在CHROMagar顯色培養(yǎng)基上上菌落為藍(lán)色色.且在其周圍形形成一個(gè)暈環(huán)環(huán)。李斯特氏氏菌在OXA瓊脂平板上生生長22

h后菌落呈現(xiàn)黑黑色.直徑為1mm.在其周圍形成成一個(gè)黑色環(huán)環(huán)。培養(yǎng)48h，菌落仍呈黑黑色.直徑2mm

--3mm.除在菌落周圍圍有一環(huán)外.在菌落中心部部位的深層也也形成黑點(diǎn)。。李斯特氏菌菌在PALCAM瓊脂平板上與與在()XA瓊脂平板上菌菌落相似。在在CHROMagar顯色培養(yǎng)基及及OXA或PALCAM瓊脂平板上挑挑取5個(gè)或更多可疑疑菌落.接種于TSA-YE瓊脂平板上.純培養(yǎng)后進(jìn)鑒鑒定。5.鑒定和確認(rèn)Skjerve等通過包被單單克隆抗體的的磁珠從不同同食物樣品中中分離李斯特特菌，采用將將磁珠接種到到瓊脂平板培培養(yǎng)的方法進(jìn)進(jìn)行菌株鑒定定，此法的敏敏感性為102～104cfu/mL樣品。Hudson等研究表明，，將免疫磁珠珠技術(shù)與PCR結(jié)合，24h內(nèi)即可檢出火火腿中的單增增李斯特菌。。沙門氏菌的檢檢測(cè)Notzon等用IMB-熒光PCR檢測(cè)肉類中的的沙門氏菌，，實(shí)驗(yàn)包括非非選擇性增菌菌、免疫磁珠珠分離、DNA提取及PCR擴(kuò)增，12～13h即可完成檢測(cè)測(cè)過程，IMB-熒光PCR在檢測(cè)自然感感染肉類和人人工感染肉類類都具有較高高的敏感性和和特異性。Blackburn等將用生物素素標(biāo)記的抗沙沙門菌多價(jià)多多克隆抗體連連接到鏈霉親親和素包被的的磁珠上，以以此試劑檢測(cè)測(cè)從不同食物物中提取的活活沙門菌。此此法的敏感性性可達(dá)105cfu/g食物，總的檢檢測(cè)時(shí)間從5d減少至1~2d。IMB技術(shù)檢測(cè)沙門門氏菌的優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)適用于各類食食品基質(zhì)中的的沙門氏菌的的快速檢測(cè)，，能快速有效效富集食品基基質(zhì)中的目標(biāo)標(biāo)病原菌，且且有良好的靈靈敏度和特異異性，檢測(cè)限限可達(dá)到1—10cfu/25g;在檢測(cè)時(shí)間方方面可將常規(guī)規(guī)檢測(cè)方法中中的72小時(shí)檢測(cè)周期期縮短至40小時(shí)，而且能能有效減輕過過程交叉污染染;篩選結(jié)果既可可以與常規(guī)的的細(xì)菌生化和和血清學(xué)聯(lián)用用，也可以和和顯色培養(yǎng)基基、熒光PCR以及微生物全全自動(dòng)鑒定儀儀器等方法聯(lián)聯(lián)用，為食源源性致病菌檢檢測(cè)和鑒定提提供有效快速速篩選技術(shù)。。金黃色葡萄球球菌的檢測(cè)陳伶俐等將人人IgG結(jié)合到磁珠上上，用該磁珠珠對(duì)樣品中的的金黃色葡萄萄球菌進(jìn)行快快速分離檢驗(yàn)驗(yàn)。取適量免免疫磁珠，加加入金黃葡萄萄球菌菌液中中，磁場(chǎng)下分分離磁珠，將將分離前后的的菌液及磁珠珠涂平板，并并用大腸桿菌菌、白葡萄球球菌等作對(duì)照照。結(jié)果用此此磁珠分離后后，只有金黃黃葡萄球菌的的濃度有明顯顯的降低。對(duì)對(duì)磁珠所涂平平板的菌落進(jìn)進(jìn)行鑒定，證證明為金黃葡葡萄球菌。應(yīng)應(yīng)用此法分離離檢驗(yàn)此菌，，富集速度快快，靈敏度高高，效果好。。劉琳琳利用自自制的金屬螯螯合免疫磁珠珠來檢測(cè)食品品中金黃色葡葡萄球菌，該該法能夠在30min內(nèi)富集檢測(cè)金金黃色葡萄球球菌且檢測(cè)低低限可達(dá)100CFU，同時(shí)磁珠可可保持活性達(dá)達(dá)3周以上。副溶血性弧菌菌的檢測(cè)Hara-Kudo等利用IMS和顯色培養(yǎng)基基分離貝類中中產(chǎn)TDH的副溶血性弧弧菌O3:K6。Datta等利用副溶血血性弧菌ATCC17802制備針對(duì)極鞭鞭毛的單克隆隆抗體,這將有益于快快速檢測(cè)從環(huán)環(huán)境來源的副副溶血性弧菌菌。張凡非等利用用IMS分離環(huán)境及食食品中產(chǎn)生TDH副溶血性弧菌菌，分別從1份海水、1份海泥和3份蛤肉中檢出出了神奈川現(xiàn)現(xiàn)象陽性,并產(chǎn)生耐熱溶溶血毒素的副副溶血性弧菌菌,血清型為03:K6。IMB技術(shù)檢測(cè)副溶溶血性弧菌的的優(yōu)點(diǎn)該方法與一般般的細(xì)菌培養(yǎng)養(yǎng)分離法相比比,極大地提高了了環(huán)境樣品及及食品中病原原性副溶血性性弧菌的檢出出率。利用IMB可有效地吸附附、濃縮大量量樣品中的少少量病原微生生物,IMB為難于從環(huán)境境及食品中分分離病原性副副溶血性弧菌菌的問題提供供一種有效手手段。其他致病菌的的檢測(cè)志賀氏菌例：Islam等應(yīng)用O抗原特異性單單克隆抗體包包被免疫磁珠珠，快速檢測(cè)測(cè)糞便中的疾疾痢志賀菌和和福氏志賀菌菌。分離出的的志賀菌株用用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行行鑒定。此種種免疫磁珠分分離與PCR聯(lián)合法檢測(cè)志志賀菌，較傳傳統(tǒng)的培養(yǎng)法法敏感、快速速(7h)。小腸結(jié)腸炎耶耶爾森氏菌例：Kapperud等用抗小腸結(jié)結(jié)腸炎耶爾森森氏菌血清抗抗體包被磁性性微球，從食食物和水樣中中分離，并能能將小腸結(jié)腸腸炎耶爾森氏氏菌與假結(jié)核核耶爾森氏菌菌和非致病性性耶爾森氏菌菌區(qū)別開來。。十三免免疫疫磁珠珠與其其它檢檢測(cè)手手段的的聯(lián)用用免疫磁磁珠與與PCR的聯(lián)用用由于PCR技術(shù)靈靈敏度度較低低，將將免疫疫磁珠珠技術(shù)術(shù)和PCR技術(shù)相相結(jié)合合，建建立了了新的的檢測(cè)測(cè)系統(tǒng)統(tǒng)——磁免疫疫PCR技術(shù)。。例如如：它它以李李斯特特氏菌菌單抗抗包被被磁珠珠，對(duì)對(duì)樣品品進(jìn)行行前處處理，，將菌菌進(jìn)行行富集集裂解解，再再以iap基因的的保守守區(qū)域域設(shè)計(jì)計(jì)引物物進(jìn)行行PCR，結(jié)果果顯示示該方方法具具有良良好特特異性性，而而且十十分靈靈敏。。免疫磁磁珠與與ELISA的聯(lián)用用利用磁磁性微微球，，并以以兔抗抗甘草草蛋白白IgG抗體致致敏，，制備備特異異性捕捕獲甘甘草特特征蛋蛋白的的免疫疫磁性性微球球。以以生物物素標(biāo)標(biāo)記抗抗體為為示蹤蹤抗體體，結(jié)結(jié)合辣辣根過過氧化化物酶酶標(biāo)親親和素素建立立ELISA檢測(cè)系系統(tǒng)，，用于于甘草草藥材材和含含甘草草中成成藥中中甘草草蛋白白的分分析。。結(jié)果果用用該方方法對(duì)對(duì)甘草草藥材材和中中成藥藥中甘甘草蛋蛋白抗抗原檢檢測(cè)，，檢測(cè)測(cè)靈敏敏度10ng／mL。免疫磁磁性捕捕獲ELISA檢測(cè)技技術(shù)方方便、、快速速、準(zhǔn)準(zhǔn)確，，為生生藥的的品種種鑒定定及中中成藥藥的質(zhì)質(zhì)量控控制提提供一一種新新方法法。免疫磁磁珠與與發(fā)光光檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)聯(lián)用用將磁磁珠珠技技術(shù)術(shù)與與免免疫疫熒熒光光、、放放射射免免疫疫、、發(fā)發(fā)光光免免疫疫等等相相結(jié)結(jié)合合，，可可提提高高分分析析檢檢測(cè)測(cè)的的準(zhǔn)準(zhǔn)確確性性和和靈靈敏敏度度。。免疫疫磁磁珠珠熒熒光光微微球球十四四免免疫疫磁磁珠珠（（IMB）技技術(shù)術(shù)在在其其他他領(lǐng)領(lǐng)域域中中的的應(yīng)應(yīng)用用免疫疫檢檢測(cè)測(cè)IMB技術(shù)術(shù)在在醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)領(lǐng)領(lǐng)域域有有廣廣闊闊應(yīng)應(yīng)用用前前景景，，它它可可以以檢檢測(cè)測(cè)腫腫瘤瘤細(xì)細(xì)胞胞，，如如骨骨髓髓中中腫腫瘤瘤細(xì)細(xì)胞胞的的檢檢測(cè)測(cè)、、淋淋巴巴結(jié)結(jié)中中腫腫瘤瘤細(xì)細(xì)胞胞的的檢檢測(cè)測(cè)。。另另外外這這種種技技術(shù)術(shù)還還可可以以對(duì)對(duì)腫腫瘤瘤進(jìn)進(jìn)行行磁磁導(dǎo)導(dǎo)向向治治療療和和免免疫疫磁磁性性凈凈化化治治療療。。細(xì)胞胞分分離離細(xì)胞胞分分離離是是免免疫疫磁磁珠珠目目前前最最主主要要應(yīng)應(yīng)用用的的一一個(gè)個(gè)方方面面，，傳傳統(tǒng)統(tǒng)細(xì)細(xì)胞胞分分離離技技術(shù)術(shù)有有的的比比較較費(fèi)費(fèi)時(shí)時(shí)，，有有的的十十分分昂昂貴貴，，由由于于免免疫疫磁磁珠珠技技術(shù)術(shù)分分離離細(xì)細(xì)胞胞時(shí)時(shí)只只需需要要抗抗體體和和磁磁鐵鐵，，既既簡簡便便靈靈敏敏又又經(jīng)經(jīng)濟(jì)濟(jì)快快捷捷。。如馬馬東東初初用用GPⅡⅡb/ШШa血小小板板單單克克隆隆抗抗體體結(jié)結(jié)合合磁磁珠珠分分離離人人骨骨中中的的巨巨核核細(xì)細(xì)胞胞，，其其純純度度達(dá)達(dá)到到87.5%到97.1%，且且50%的巨巨核核細(xì)細(xì)胞胞具具有有生生物物活活性性，，分分離離的的巨巨核核細(xì)細(xì)胞胞超超微微結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)保保持持完完整整，，可可用用于于巨巨核核細(xì)細(xì)胞胞的的分分子子生生物物學(xué)學(xué)等等方方面面研研究究。。生物物大大分分子子純純化化免疫疫磁磁珠珠可可以以看看作作是是親親和和層層析析技技術(shù)術(shù)中中的的微微型型配配基基，，體體，，在在基基質(zhì)質(zhì)上上固固相相化化抗抗體體或或抗抗原原后后，，形形成成特特異異性性吸吸附附后后，，再再進(jìn)進(jìn)行行磁磁性性親親和和抽抽屜屜不不需需離離心心過過濾濾，，用用于于分分離離和和純純化化相相應(yīng)應(yīng)的的生生物物大大分分子子。。為為提提純純受受體體分分子子、、DNA、RNA、DNA結(jié)合合蛋蛋白白及及mRNA等提供希希望。分子生物物學(xué)的應(yīng)應(yīng)用免疫磁珠珠可借助助親和素素——生物素系系統(tǒng)與非非蛋白結(jié)結(jié)合（如如各種DNA、RNA大分子））。先將將PCR雙鏈產(chǎn)物物與生物物素化的的磁珠混混合使兩兩者結(jié)合合，然后后進(jìn)行堿堿性變性性處理，，使PCR雙股DNA成為單股股DNA，可直接接快速用用于檢測(cè)測(cè)PCR樣品中DNA或RNA分子并可可進(jìn)行測(cè)測(cè)序。十五免免疫磁珠珠技術(shù)展展望優(yōu)點(diǎn):分離速度度快、效效率高、、可重復(fù)復(fù)性好、、操作簡簡單，不不需昂貴貴儀器設(shè)設(shè)備,不影響被被分離細(xì)細(xì)胞或其其它生物物材料的的生物學(xué)學(xué)性狀和和功能等等,從而在微微生物檢檢測(cè)方面面具有很很大的優(yōu)優(yōu)勢(shì)。缺點(diǎn)：免免疫磁珠珠敏感性性不高，，易于其其他雜菌菌交叉反反應(yīng)，價(jià)價(jià)格昂貴貴，應(yīng)用用受到一一定限制制。IMB發(fā)展的幾幾個(gè)方向向高敏感性性磁珠的的制造技技術(shù)降低磁珠珠生產(chǎn)成成本免疫磁珠珠與其它它檢測(cè)手手段聯(lián)用用技術(shù)免疫磁珠珠技術(shù)應(yīng)應(yīng)用技術(shù)術(shù)總的來說說，免疫疫磁珠分分離技術(shù)術(shù)未來將將在生物物醫(yī)學(xué)、、食品、、農(nóng)業(yè)科科研、新新藥開發(fā)發(fā)等領(lǐng)域域具有更更加廣泛泛的發(fā)展展前景。。Thankyouattention！9、靜夜四無無鄰，荒居居舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Wednesday,December28,202210、雨雨中中黃黃葉葉樹樹，，燈燈下下白白頭頭人人。。。。21:26:4921:26:4921:2612/28/20229:26:49PM11、以我獨(dú)獨(dú)沈久，，愧君相相見頻。。。12月-2221:26:4921:26Dec-2228-Dec-2212、故人人江海海別，，幾度度隔山山川。。。21:26:4921:26:4921:26Wednesday,December28,202213、乍見翻翻疑夢(mèng)，，相悲各各問年。。。12月-2212月-2221:26:4921:26:49December28,202214、他鄉(xiāng)生白發(fā)發(fā)，舊國見青青山。。28十二月月20229:26:49下午21:26:4912月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月2