第3章臨床微生物學(xué)

檢驗技術(shù)

1PPT課件第3章臨床微生物學(xué)1PPT課件請回答一下問題哪些細菌適合直接涂片檢查？直接涂片檢查能為臨床提供哪些信息？細菌分離培養(yǎng)和鑒定常用的培養(yǎng)基有哪些特點？與分離培養(yǎng)相比，應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測有哪些優(yōu)缺點？臨床微生物檢驗的任務(wù)?2PPT課件請回答一下問題哪些細菌適合直接涂片檢查？2PPT課件一、細菌形態(tài)學(xué)檢驗不染色標本檢查生活狀態(tài)下細菌的動力及運動狀況壓滴法和懸滴法病原菌初步鑒定：霍亂弧菌制動試驗染色標本革蘭染色抗酸染色熒光染色鞭毛染色莢膜染色特殊染色：異染顆粒、芽胞染色、墨汁染色3PPT課件一、細菌形態(tài)學(xué)檢驗不染色標本3PPT課件一、細菌形態(tài)學(xué)檢驗（一）制片

1.涂片取潔凈載玻片一張，用標記筆一分為二，用接種環(huán)取生理鹽水2環(huán)，分別置于玻片兩端，接種環(huán)滅菌后，取金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)物少許與鹽水混勻，并涂成均勻薄膜涂片。接種環(huán)滅菌后以同樣方法再取大腸埃希菌少許，與另一端生理鹽水混勻后涂成均勻薄膜。如用液體材料，如痰、尿液、膿汁等可直接涂片，不必加生理鹽水。

4PPT課件一、細菌形態(tài)學(xué)檢驗（一）制片4PPT課件2.干燥涂片最好在室溫下自然干燥，必要時可將標本面向上，小心間斷地在弱火高處烘干，但切勿緊靠火焰將涂膜烤枯。

3.固定涂片干燥后，將標本片在酒精燈上快速的來回通過三次，共約2s～3s，注意溫度不可太高，以涂片涂膜的反面觸及皮膚覺輕微燙覺即可。固定目的：①殺死細菌；②使菌體與玻片粘附較牢，在染色時不致被染液和水沖掉；③菌體蛋白變性易著色。5PPT課件2.干燥涂片最好在室溫下自然干燥，必涂片干燥固定染色鏡檢6PPT課件涂片干燥固定染色鏡檢6PPT課件（二）革蘭染色法1.原理

（1）革蘭陽性細菌細胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易滲入；革蘭陰性菌細胞壁結(jié)構(gòu)較疏松，肽聚糖層少，脂質(zhì)含量多，乙醇易滲入。

（2）革蘭陽性菌的等電點低，革蘭陰性菌的等電點較高，在相同pH條件下，革蘭陽性菌所帶負電荷比革蘭陰性菌多，與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢固不易脫色。

（3）革蘭陽性菌細胞內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與結(jié)晶紫和碘牢固的結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被乙醇脫色；而革蘭陰性菌細胞內(nèi)含極少量的核糖核酸鎂鹽，吸附染料量少，形成的復(fù)合物分子也較小，故易被乙醇脫色。7PPT課件（二）革蘭染色法7PPT課件2.染色方法（1）標本涂片、干燥和固定。

（2）染色：在已固定細菌涂片上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴，室溫作用1min，用細流水輕輕沖洗，甩去積水。再滴加碘液數(shù)滴，室溫作用1min，沖洗。滴加95%酒精數(shù)滴，輕輕搖動玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，使脫掉的染料隨酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精無色為止（約需30s），立即用細流水將酒精沖掉。再滴加稀釋石炭酸復(fù)紅液復(fù)染約30s后用細流水沖洗。

（3）標本染色后，晾干或用吸水紙吸干，滴香柏油后用油鏡觀察。

8PPT課件2.染色方法8PPT課件9PPT課件9PPT課件3.結(jié)果紫色為革蘭陽性菌，紅色為革蘭陰性菌。10PPT課件3.結(jié)果10PPT課件（二）抗酸染色1.原理分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多，其中主要成分為分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用，因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色，達到染色目的。11PPT課件（二）抗酸染色11PPT課件2.方法（1）萋納石炭酸復(fù)紅染色，加溫促使菌體著色5min；（2）流水沖洗，3%鹽酸酒精脫色1~3min；（3）呂氏美藍復(fù)染30s。12PPT課件2.方法12PPT課件13PPT課件13PPT課件3.結(jié)果未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌,脫色經(jīng)復(fù)染呈藍色的細菌為非抗酸性細菌。14PPT課件3.結(jié)果14PPT課件（三）鞭毛染色1.原理細菌的鞭毛能被堿性復(fù)紅酒精飽和溶液著色，是因為在染色過程中隨著酒精的蒸發(fā)其染料沉積在鞭毛上，使鞭毛著色。堿性復(fù)紅作為主要染料，而丹寧酸為媒染劑。15PPT課件（三）鞭毛染色15PPT課件2.方法（1）采用點種法接種的變形桿菌（或其他鞭毛菌），近離接種點的菌，鞭毛細，菌體較短；遠離接種點的菌，鞭毛粗，菌體長，用無菌接種環(huán)取遠離接種點的菌混懸于盛有無菌蒸溜水的平皿內(nèi)，不要研磨以免鞭毛脫落，置室溫放置10～15min，使鞭毛膨大。

（2）用毛細滴管將菌液滴于潔凈的玻片上，緩慢傾斜玻片任菌液流開，始之成為均勻薄膜，將玻片置37℃溫箱內(nèi)，任其自然干燥，切勿用火焰固定。

（3）在干燥標本片上滴加鞭毛染色液1～2滴，使覆蓋于薄膜上，作用1～2min后輕輕用水沖，干后鏡檢觀察。16PPT課件2.方法16PPT課件3.結(jié)果菌體染成紅色（或深紫色），鞭毛染成淡紅色（或淡紫色），染色時間越長，鞭毛越粗。17PPT課件3.結(jié)果17PPT課件（四）莢膜染色1.原理莢膜為細菌細胞壁外圍的黏液層，對染料的親和力很低，用一般染色不易著色，必須通過莢膜染色方法或襯托染色，方能清晰辨認出莢膜。2.方法用有莢膜的細菌培養(yǎng)物涂片，火焰固定，固定標本后加1%結(jié)晶紫染液，室溫保持1min后，倒去染液，然后用20%硫酸銅水溶液沖洗染液，勿水洗。待干后鏡檢觀察。18PPT課件（四）莢膜染色18PPT課件3.結(jié)果菌體為深紫色，莢膜為無色或淡紫色。19PPT課件3.結(jié)果19PPT課件（四）墨汁染色1.原理

2.方法

20PPT課件（四）墨汁染色20PPT課件3.結(jié)果菌體為深紫色，莢膜為無色或淡紫色。21PPT課件3.結(jié)果21PPT課件（一）培養(yǎng)基分類成分用途形態(tài)

血平板巧克力血平板22PPT課件（一）培養(yǎng)基分類22PPT課件伊紅美藍平板

麥康凱平板

SS平板M-H平板23PPT課件伊紅美藍平板麥康凱平板SS平板M-H平板23PPT課件培養(yǎng)基的選擇根據(jù)標本來源和可能存在的病原菌血平板巧克力血平板中國藍平板或伊紅亞甲藍平板麥康凱平板SS瓊脂堿性瓊脂或TCBS瓊脂血液增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯24PPT課件培養(yǎng)基的選擇24PPT課件分離培養(yǎng)細菌的分離平板劃線分離法斜面接種法液體接種法穿刺接種法傾注培養(yǎng)法涂布接種法25PPT課件分離培養(yǎng)細菌的分離25PPT課件二、分離培養(yǎng)（一）劃線接種1.方法斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法。斜線法26PPT課件二、分離培養(yǎng)（一）劃線接種斜線法26PPT課件曲線法方格法27PPT課件曲線法方格法27PPT課件放射法四格法28PPT課件放射法四格法28PPT課件29PPT課件29PPT課件分離培養(yǎng)細菌培養(yǎng)方法需氧培養(yǎng)法二氧化碳培養(yǎng)法厭氧培養(yǎng)法30PPT課件分離培養(yǎng)細菌培養(yǎng)方法30PPT課件三、生化反應(yīng)酶系統(tǒng)對底物的分解能力代謝產(chǎn)物掌握各種生化反應(yīng)的原理和應(yīng)用是細菌鑒定的基礎(chǔ)31PPT課件三、生化反應(yīng)酶系統(tǒng)31PPT課件三、生化反應(yīng)（一）碳水化合物的代謝試驗

1.糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗

原理：不同種類細菌含有發(fā)酵不同糖（醇、苷）類的酶，因而對各種糖（醇、苷）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、苷）類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而異。檢查細菌對培養(yǎng)基中所含糖（醇、苷）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用以鑒定細菌種類。

方法：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（如酚紅肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）類。所使用的糖（醇、苷）類有很多種。將待鑒定的純培養(yǎng)細菌接種入試驗培養(yǎng)基中，置35℃孵育箱內(nèi)孵育數(shù)小時后，觀察結(jié)果;若用微量發(fā)酵管，或要求培養(yǎng)時間較長時。32PPT課件三、生化反應(yīng)（一）碳水化合物的代謝試驗32PPT課件

結(jié)果：能分解糖（醇、苷）產(chǎn)酸的細菌，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)（如酚紅變?yōu)辄S色），產(chǎn)氣的細菌可在小倒管（Durham小管）中產(chǎn)生氣泡，固體培養(yǎng)基則產(chǎn)生裂隙。不分解糖則無變化。

應(yīng)用：是鑒定細菌最主要和最基本的試驗，特別對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要。33PPT課件

結(jié)果：能分解糖（醇、苷）產(chǎn)酸的細菌，培養(yǎng)基中的指示2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗(O-F試驗）

原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；能進行無氧降解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖，而氧化型細菌在無氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖。本試驗又稱氧化發(fā)酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）試驗，可用于區(qū)別細菌的代謝類型。

方法：挑取少許純培養(yǎng)物（不要從選擇性平板中挑?。┙臃N1支HL培養(yǎng)管中，從培養(yǎng)基表面穿刺到其底部。置35℃孵箱孵育48h以上。34PPT課件2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗(O-F試驗）34PPT課件

結(jié)果：培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為陰性；培養(yǎng)基表面和底部都產(chǎn)酸（變黃）為發(fā)酵型；培養(yǎng)基表面變?yōu)樯钏{色為產(chǎn)堿型；培養(yǎng)基表面變黃、底部不色變?yōu)檠趸汀?為產(chǎn)堿型2為氧化型3為發(fā)酵型

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與其他非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球菌（氧化型）。35PPT課件結(jié)果：培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為陰性；培養(yǎng)基表面3．甲基紅（MR）試驗

原理：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培養(yǎng)基pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑呈紅色。如細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)（如醇、醛、酮、氣體和水），培養(yǎng)基pH在5.4以上，加入甲基紅指示劑呈桔黃色。

方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育48~96h后，于5ml培養(yǎng)基中滴加5~6滴甲基紅指示劑，立即觀察結(jié)果。36PPT課件3．甲基紅（MR）試驗

原理：某些細菌在糖代謝過程

結(jié)果判定：呈現(xiàn)紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱陽性。

應(yīng)用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性。37PPT課件結(jié)果判定：呈現(xiàn)紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱4．Β-半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）

原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些細菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。

方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，觀察結(jié)果。38PPT課件4．Β-半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）

38PPT課件結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。39PPT課件結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。39PPT課件

應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細菌的快速鑒定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細菌均可短時間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。40PPT課件應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細菌的快速鑒定，本法對于迅速5．VP試驗

原理：測定細菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力。某些細菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧形成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進而與培養(yǎng)基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結(jié)合形成紅色化合物。即V-P試驗陽性。

方法：將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，輕輕振搖試管，然后加0.2ml400g/LKOH，輕輕振搖試管30s至1min，然后靜置觀察結(jié)果。41PPT課件5．VP試驗

41PPT課件

結(jié)果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為陰性42PPT課件結(jié)果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為陰性42PPT課

應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本試驗常與MR試驗一起使用，一般情況下，前者為陽性的細菌，后者常為陰性，反之亦然。43PPT課件應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本試6．膽汁七葉苷水解試驗

原理：在10%~40％膽汁存在下，測定細菌水解七葉苷的能力。七葉苷被細菌分解生成的七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物。

方法：將被檢菌接種于膽汁七葉苷培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h后，觀察結(jié)果。

結(jié)果：培養(yǎng)基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。

應(yīng)用：主要用于鑒別腸球菌與其他鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如脆弱擬桿菌等）的初步鑒別。腸球菌本試驗為陽性。44PPT課件6．膽汁七葉苷水解試驗44PPT課件（二）細菌對于蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗

1.明膠液化試驗

原理：某些細菌可產(chǎn)生一種胞外酶-明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。方法：將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于22℃培養(yǎng)7d，逐日觀察結(jié)果。若用35℃孵育，因明膠在此溫度下自行液化，故在觀察結(jié)果前，先置4℃冰箱內(nèi)30min，再看結(jié)果。45PPT課件（二）細菌對于蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗45PPT課件

結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。應(yīng)用：腸桿菌科細菌的鑒別，如沙雷菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、陰溝桿菌等可液化明膠，而其他細菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。46PPT課件結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。46PPT課件陰性陽性47PPT課件陰性陽性47PPT課件2.吲哚（靛基質(zhì)）試驗

原理：某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)），當(dāng)加入吲哚試劑（對二甲氨基苯甲醛）后則形成紅色的玫瑰吲哚。培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)24～48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑。結(jié)果：于兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。48PPT課件2.吲哚（靛基質(zhì)）試驗48PPT課件49PPT課件49PPT課件3.硫化氫試驗

原理：某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛或亞鐵離子則形成黑褐色的硫化鉛或硫化鐵沉淀。此試驗可間接檢測細菌是否產(chǎn)生硫化氫。培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。方法：將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。50PPT課件3.硫化氫試驗50PPT課件

結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮?。?yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。如沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬細菌，絕大多數(shù)硫化氫陽性，其他菌屬陰性。沙門菌屬中也有硫化氫陰性菌種。51PPT課件結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?1PPT課件52PPT課件52PPT課件4.尿素分解試驗

原理：某些細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)18～24h觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮?。?yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽性。另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。53PPT課件4.尿素分解試驗53PPT課件陽性陰性陰性54PPT課件陽性陰性陰性54PPT課件5.苯丙氨酸脫氨酶試驗

原理：某些細菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基。方法：將被檢菌濃厚接種于苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于35℃培養(yǎng)18～24h，滴加10％三氯化鐵試劑3～4滴，自斜面上方流下。55PPT課件5.苯丙氨酸脫氨酶試驗55PPT課件

結(jié)果：出現(xiàn)綠色為陽性。應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長反應(yīng)時問會引起褪色。加氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色為陽性56PPT課件結(jié)果：出現(xiàn)綠色為陽性。應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長反應(yīng)時問會

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和摩根菌屬細菌均為陽性，腸桿菌種中其他細菌均為陰性。57PPT課件應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威6.氨基酸脫羧酶試驗

原理：具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿。使指示劑顯示出來。培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基。方法：將被檢菌分別接種于賴氨酸（或鳥氨酸或精氨酸）培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基中，并加入無菌液體石蠟或礦物油，于35℃培養(yǎng)1～4d，每日觀察結(jié)果。58PPT課件6.氨基酸脫羧酶試驗58PPT課件

結(jié)果：孵育后，對照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色（指示劑為溴甲酚紫）為陽性；若測定管呈黃色為陰性。若對照管呈現(xiàn)紫色則試驗無意義，重新做試驗。氨基酸對照鳥氨酸賴氨酸鳥氨酸為陽性賴氨酸為陰性氨基酸對照59PPT課件結(jié)果：孵育后，對照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色（指示劑為

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。如沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其余沙門菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。60PPT課件應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。如沙門菌屬中除傷寒（三）碳源和氮源利用試驗

1.枸櫞酸鹽利用試驗

原理：某些細菌能以銨鹽為唯一氮源，并且利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽，使培養(yǎng)基變堿性。培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基。方法：將被檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)1～4d，每日觀察結(jié)果。61PPT課件（三）碳源和氮源利用試驗61PPT課件

結(jié)果：培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{色為陽性；不能利用枸櫞酸鹽作為碳源的細菌，在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基則不變色，為陰性。62PPT課件結(jié)果：培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{色

應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。在腸桿菌科中埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常為陽性。63PPT課件應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。在腸桿菌科中埃希菌2.丙二酸鹽試驗原理：丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細菌鑒定中的一個鑒別性特征。許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，抑制了三羧酸循環(huán)。培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基接種：用幼齡菌種接種測定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫培養(yǎng)1～2d，觀察培養(yǎng)基變色情況。觀察結(jié)果：如測定培養(yǎng)基生長并變藍色，表示可利用丙二酸鹽，為陽性結(jié)果；如測定培養(yǎng)基未變色，則為陰性，即不利用丙二酸鹽。64PPT課件2.丙二酸鹽試驗64PPT課件2.丙二酸鹽利用試驗

（1）原理：有的細菌可利用丙二酸鹽作為唯一碳源，將丙二酸鹽分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。（2）培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基。（3）方法：將被檢菌接種于上述培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。（4）結(jié)果：培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{色為陽性，顏色無變化為陰性。（5）應(yīng)用：腸桿菌科中屬間及種的鑒別。克雷伯菌屬為陽性，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬中有些菌種也呈陽性，其他菌屬均為陰性。65PPT課件2.丙二酸鹽利用試驗65PPT課件（四）氧化酶試驗

原理：氧化酶（細胞色素氧化酶）是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。試劑：1%鹽酸四甲基對苯二胺或1%鹽酸二甲基對苯二胺。方法：

1.菌落法直接滴加試劑于被檢菌菌落上。

2.濾紙法取潔凈濾紙一小塊，沾取菌少許，然后加試劑。

3.試劑紙片法將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。66PPT課件（四）氧化酶試驗66PPT課件

結(jié)果：細菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈（二甲基對苯二胺鹽酸鹽為紫紅色，四甲基對苯二胺鹽酸鹽為藍色）為陽性。分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應(yīng)。67PPT課件結(jié)果：細菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈（二甲基對苯二胺鹽酸（五）觸酶試驗原理：具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。試劑：3%過氧化氫溶液。方法：取菌落置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，然后加3%過氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3%過氧化氫于不含血液的細菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。結(jié)果：有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。應(yīng)用：革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，而鏈球菌屬為陰性，故此試驗常用于革蘭陽性球菌的初步分群。68PPT課件（五）觸酶試驗68PPT課件69PPT課件69PPT課件（六）硝酸鹽還原試驗原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個過程：一是在合成過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細胞內(nèi)其他含氮化合物；二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。能使硝酸鹽還原的細菌從硝酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其他還原性產(chǎn)物。但硝酸鹽還原的過程因細菌不同而異，有的細菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌；有的細菌則可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如假單胞菌等。硝酸鹽還原試驗系測定還原過程中所產(chǎn)生的亞硝酸。培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基。試劑：甲液（對氨基苯磺酸0.8g+5mol／L醋酸100ml；乙液（α-奈胺0.5g+5mol/L醋酸100ml）。方法：被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)1～4d，將甲、乙液等量混合后（約0.1ml）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果。70PPT課件（六）硝酸鹽還原試驗70PPT課件

結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性。若加入試劑后無顏色反應(yīng)，可能是：

1.硝酸鹽沒有被還原，試驗陰性；

2.硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，這時應(yīng)在試管內(nèi)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗確實為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表示試驗為假陰性。若要檢查是否有氮氣產(chǎn)生，可在培養(yǎng)基管內(nèi)加一小倒管，如有氣泡產(chǎn)生，表示有氮氣生成醫(yī)`學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。應(yīng)用：本試驗在細菌鑒定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮氣；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗也為陽性。71PPT課件結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性。若加入試劑后無顏色反應(yīng)，可能是72PPT課件72PPT課件（七）DNA酶試驗原理：某些細菌產(chǎn)生DNA酶，可使長鏈DNA水解成寡核苷酸鏈。因為長鏈DNA可被酸沉淀，寡核苷酸鏈則溶于酸，所以當(dāng)菌落平板上加入酸后，會在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)。培養(yǎng)基：0.2％DNA瓊脂平板。方法：將被檢菌點種于上述平板上，于35℃培養(yǎng)18～24h，用lmol/L鹽酸覆蓋平板，觀察結(jié)果。結(jié)果：在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽性，無透明環(huán)為陰性。應(yīng)用：在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶，故本試驗可用于細菌的鑒別。73PPT課件（七）DNA酶試驗73PPT課件74PPT課件74PPT課件（八）凝固酶試驗原理：葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶。一種是結(jié)合凝固酶，結(jié)合在細胞壁上，使血漿中的纖維蛋白原變成纖維蛋白而附著于細菌表面，發(fā)生凝集：可用玻片法測出。另一種是分泌至菌體外的游離凝固酶。作用類似凝血酶原物質(zhì)，可被血漿中的協(xié)同因子激活變?yōu)槟笜游镔|(zhì)，而使纖維蛋白原變成纖維蛋白，從而使血漿凝固，可用試管法測出。方法：

1.玻片法取兔血漿和鹽水各一滴，分別置于潔凈的玻片上，挑取被檢菌分別與血漿和鹽水混合。

2.試管法取試管2支，各加0.5ml人或兔血漿，挑取被檢菌和陽性對照菌分別加入血漿中并混勻，于37℃水浴3～4h。75PPT課件（八）凝固酶試驗75PPT課件

結(jié)果：玻片法以血漿中有明顯的顆粒出現(xiàn)而鹽水中無自凝現(xiàn)象判為陽性；試管法以血漿凝固判為陽性。陰性陽性76PPT課件結(jié)果：玻片法以血漿中有明顯的顆粒出現(xiàn)而鹽水中無自凝現(xiàn)試管法凝固酶試驗77PPT課件試管法凝固酶試驗77PPT課件

應(yīng)用：作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標，也是葡萄球菌鑒別時常用的一個試驗。78PPT課件應(yīng)用：作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標，也是葡萄球菌（九）CAMP試驗（ChristisAtkins&Munch-PetersonTest,CAMP）

原理：B群鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，可促進葡萄球菌的β–溶血素溶解紅細胞的活性，因此在兩菌（B群鏈球菌和葡萄球菌）的交界處溶血力增加，出現(xiàn)矢狀（半月形）的溶血區(qū)。培養(yǎng)基：血瓊脂平板。應(yīng)用：在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗陽性，故可作為特異性鑒定。79PPT課件（九）CAMP試驗（ChristisAtkins&Mu1為陰性2為陰性3為陽性4為陰性80PPT課件1為陰性80PPT課件細菌的非培養(yǎng)檢測方法免疫學(xué)檢測分子生物學(xué)檢測質(zhì)譜分析法（massspectrometry,MS）傳統(tǒng)鑒定方法：通過趨向性試驗對細菌進行初步分類，再通過一系列生物特征將細菌鑒定到屬、種或亞種18小時甚至更長應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究不同微生物用過質(zhì)譜分析得到指紋譜，從而快速鑒定培養(yǎng)2-3小時菌落轉(zhuǎn)移到靶板風(fēng)干后1min得到鑒定結(jié)果細菌毒素檢測動物實驗81PPT課件細菌的非培養(yǎng)檢測方法免疫學(xué)檢測81PPT課件第3章臨床微生物學(xué)

檢驗技術(shù)

82PPT課件第3章臨床微生物學(xué)1PPT課件請回答一下問題哪些細菌適合直接涂片檢查？直接涂片檢查能為臨床提供哪些信息？細菌分離培養(yǎng)和鑒定常用的培養(yǎng)基有哪些特點？與分離培養(yǎng)相比，應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測有哪些優(yōu)缺點？臨床微生物檢驗的任務(wù)?83PPT課件請回答一下問題哪些細菌適合直接涂片檢查？2PPT課件一、細菌形態(tài)學(xué)檢驗不染色標本檢查生活狀態(tài)下細菌的動力及運動狀況壓滴法和懸滴法病原菌初步鑒定：霍亂弧菌制動試驗染色標本革蘭染色抗酸染色熒光染色鞭毛染色莢膜染色特殊染色：異染顆粒、芽胞染色、墨汁染色84PPT課件一、細菌形態(tài)學(xué)檢驗不染色標本3PPT課件一、細菌形態(tài)學(xué)檢驗（一）制片

1.涂片取潔凈載玻片一張，用標記筆一分為二，用接種環(huán)取生理鹽水2環(huán)，分別置于玻片兩端，接種環(huán)滅菌后，取金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)物少許與鹽水混勻，并涂成均勻薄膜涂片。接種環(huán)滅菌后以同樣方法再取大腸埃希菌少許，與另一端生理鹽水混勻后涂成均勻薄膜。如用液體材料，如痰、尿液、膿汁等可直接涂片，不必加生理鹽水。

85PPT課件一、細菌形態(tài)學(xué)檢驗（一）制片4PPT課件2.干燥涂片最好在室溫下自然干燥，必要時可將標本面向上，小心間斷地在弱火高處烘干，但切勿緊靠火焰將涂膜烤枯。

3.固定涂片干燥后，將標本片在酒精燈上快速的來回通過三次，共約2s～3s，注意溫度不可太高，以涂片涂膜的反面觸及皮膚覺輕微燙覺即可。固定目的：①殺死細菌；②使菌體與玻片粘附較牢，在染色時不致被染液和水沖掉；③菌體蛋白變性易著色。86PPT課件2.干燥涂片最好在室溫下自然干燥，必涂片干燥固定染色鏡檢87PPT課件涂片干燥固定染色鏡檢6PPT課件（二）革蘭染色法1.原理

（1）革蘭陽性細菌細胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易滲入；革蘭陰性菌細胞壁結(jié)構(gòu)較疏松，肽聚糖層少，脂質(zhì)含量多，乙醇易滲入。

（2）革蘭陽性菌的等電點低，革蘭陰性菌的等電點較高，在相同pH條件下，革蘭陽性菌所帶負電荷比革蘭陰性菌多，與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢固不易脫色。

（3）革蘭陽性菌細胞內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與結(jié)晶紫和碘牢固的結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被乙醇脫色；而革蘭陰性菌細胞內(nèi)含極少量的核糖核酸鎂鹽，吸附染料量少，形成的復(fù)合物分子也較小，故易被乙醇脫色。88PPT課件（二）革蘭染色法7PPT課件2.染色方法（1）標本涂片、干燥和固定。

（2）染色：在已固定細菌涂片上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴，室溫作用1min，用細流水輕輕沖洗，甩去積水。再滴加碘液數(shù)滴，室溫作用1min，沖洗。滴加95%酒精數(shù)滴，輕輕搖動玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，使脫掉的染料隨酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精無色為止（約需30s），立即用細流水將酒精沖掉。再滴加稀釋石炭酸復(fù)紅液復(fù)染約30s后用細流水沖洗。

（3）標本染色后，晾干或用吸水紙吸干，滴香柏油后用油鏡觀察。

89PPT課件2.染色方法8PPT課件90PPT課件9PPT課件3.結(jié)果紫色為革蘭陽性菌，紅色為革蘭陰性菌。91PPT課件3.結(jié)果10PPT課件（二）抗酸染色1.原理分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多，其中主要成分為分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用，因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色，達到染色目的。92PPT課件（二）抗酸染色11PPT課件2.方法（1）萋納石炭酸復(fù)紅染色，加溫促使菌體著色5min；（2）流水沖洗，3%鹽酸酒精脫色1~3min；（3）呂氏美藍復(fù)染30s。93PPT課件2.方法12PPT課件94PPT課件13PPT課件3.結(jié)果未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌,脫色經(jīng)復(fù)染呈藍色的細菌為非抗酸性細菌。95PPT課件3.結(jié)果14PPT課件（三）鞭毛染色1.原理細菌的鞭毛能被堿性復(fù)紅酒精飽和溶液著色，是因為在染色過程中隨著酒精的蒸發(fā)其染料沉積在鞭毛上，使鞭毛著色。堿性復(fù)紅作為主要染料，而丹寧酸為媒染劑。96PPT課件（三）鞭毛染色15PPT課件2.方法（1）采用點種法接種的變形桿菌（或其他鞭毛菌），近離接種點的菌，鞭毛細，菌體較短；遠離接種點的菌，鞭毛粗，菌體長，用無菌接種環(huán)取遠離接種點的菌混懸于盛有無菌蒸溜水的平皿內(nèi)，不要研磨以免鞭毛脫落，置室溫放置10～15min，使鞭毛膨大。

（2）用毛細滴管將菌液滴于潔凈的玻片上，緩慢傾斜玻片任菌液流開，始之成為均勻薄膜，將玻片置37℃溫箱內(nèi)，任其自然干燥，切勿用火焰固定。

（3）在干燥標本片上滴加鞭毛染色液1～2滴，使覆蓋于薄膜上，作用1～2min后輕輕用水沖，干后鏡檢觀察。97PPT課件2.方法16PPT課件3.結(jié)果菌體染成紅色（或深紫色），鞭毛染成淡紅色（或淡紫色），染色時間越長，鞭毛越粗。98PPT課件3.結(jié)果17PPT課件（四）莢膜染色1.原理莢膜為細菌細胞壁外圍的黏液層，對染料的親和力很低，用一般染色不易著色，必須通過莢膜染色方法或襯托染色，方能清晰辨認出莢膜。2.方法用有莢膜的細菌培養(yǎng)物涂片，火焰固定，固定標本后加1%結(jié)晶紫染液，室溫保持1min后，倒去染液，然后用20%硫酸銅水溶液沖洗染液，勿水洗。待干后鏡檢觀察。99PPT課件（四）莢膜染色18PPT課件3.結(jié)果菌體為深紫色，莢膜為無色或淡紫色。100PPT課件3.結(jié)果19PPT課件（四）墨汁染色1.原理

2.方法

101PPT課件（四）墨汁染色20PPT課件3.結(jié)果菌體為深紫色，莢膜為無色或淡紫色。102PPT課件3.結(jié)果21PPT課件（一）培養(yǎng)基分類成分用途形態(tài)

血平板巧克力血平板103PPT課件（一）培養(yǎng)基分類22PPT課件伊紅美藍平板

麥康凱平板

SS平板M-H平板104PPT課件伊紅美藍平板麥康凱平板SS平板M-H平板23PPT課件培養(yǎng)基的選擇根據(jù)標本來源和可能存在的病原菌血平板巧克力血平板中國藍平板或伊紅亞甲藍平板麥康凱平板SS瓊脂堿性瓊脂或TCBS瓊脂血液增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯105PPT課件培養(yǎng)基的選擇24PPT課件分離培養(yǎng)細菌的分離平板劃線分離法斜面接種法液體接種法穿刺接種法傾注培養(yǎng)法涂布接種法106PPT課件分離培養(yǎng)細菌的分離25PPT課件二、分離培養(yǎng)（一）劃線接種1.方法斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法。斜線法107PPT課件二、分離培養(yǎng)（一）劃線接種斜線法26PPT課件曲線法方格法108PPT課件曲線法方格法27PPT課件放射法四格法109PPT課件放射法四格法28PPT課件110PPT課件29PPT課件分離培養(yǎng)細菌培養(yǎng)方法需氧培養(yǎng)法二氧化碳培養(yǎng)法厭氧培養(yǎng)法111PPT課件分離培養(yǎng)細菌培養(yǎng)方法30PPT課件三、生化反應(yīng)酶系統(tǒng)對底物的分解能力代謝產(chǎn)物掌握各種生化反應(yīng)的原理和應(yīng)用是細菌鑒定的基礎(chǔ)112PPT課件三、生化反應(yīng)酶系統(tǒng)31PPT課件三、生化反應(yīng)（一）碳水化合物的代謝試驗

1.糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗

原理：不同種類細菌含有發(fā)酵不同糖（醇、苷）類的酶，因而對各種糖（醇、苷）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、苷）類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而異。檢查細菌對培養(yǎng)基中所含糖（醇、苷）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用以鑒定細菌種類。

方法：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（如酚紅肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）類。所使用的糖（醇、苷）類有很多種。將待鑒定的純培養(yǎng)細菌接種入試驗培養(yǎng)基中，置35℃孵育箱內(nèi)孵育數(shù)小時后，觀察結(jié)果;若用微量發(fā)酵管，或要求培養(yǎng)時間較長時。113PPT課件三、生化反應(yīng)（一）碳水化合物的代謝試驗32PPT課件

結(jié)果：能分解糖（醇、苷）產(chǎn)酸的細菌，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)（如酚紅變?yōu)辄S色），產(chǎn)氣的細菌可在小倒管（Durham小管）中產(chǎn)生氣泡，固體培養(yǎng)基則產(chǎn)生裂隙。不分解糖則無變化。

應(yīng)用：是鑒定細菌最主要和最基本的試驗，特別對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要。114PPT課件

結(jié)果：能分解糖（醇、苷）產(chǎn)酸的細菌，培養(yǎng)基中的指示2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗(O-F試驗）

原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；能進行無氧降解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖，而氧化型細菌在無氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖。本試驗又稱氧化發(fā)酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）試驗，可用于區(qū)別細菌的代謝類型。

方法：挑取少許純培養(yǎng)物（不要從選擇性平板中挑?。┙臃N1支HL培養(yǎng)管中，從培養(yǎng)基表面穿刺到其底部。置35℃孵箱孵育48h以上。115PPT課件2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗(O-F試驗）34PPT課件

結(jié)果：培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為陰性；培養(yǎng)基表面和底部都產(chǎn)酸（變黃）為發(fā)酵型；培養(yǎng)基表面變?yōu)樯钏{色為產(chǎn)堿型；培養(yǎng)基表面變黃、底部不色變?yōu)檠趸汀?為產(chǎn)堿型2為氧化型3為發(fā)酵型

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與其他非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球菌（氧化型）。116PPT課件結(jié)果：培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為陰性；培養(yǎng)基表面3．甲基紅（MR）試驗

原理：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培養(yǎng)基pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑呈紅色。如細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)（如醇、醛、酮、氣體和水），培養(yǎng)基pH在5.4以上，加入甲基紅指示劑呈桔黃色。

方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育48~96h后，于5ml培養(yǎng)基中滴加5~6滴甲基紅指示劑，立即觀察結(jié)果。117PPT課件3．甲基紅（MR）試驗

原理：某些細菌在糖代謝過程

結(jié)果判定：呈現(xiàn)紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱陽性。

應(yīng)用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性。118PPT課件結(jié)果判定：呈現(xiàn)紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱4．Β-半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）

原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些細菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。

方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，觀察結(jié)果。119PPT課件4．Β-半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）

38PPT課件結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。120PPT課件結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。39PPT課件

應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細菌的快速鑒定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細菌均可短時間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。121PPT課件應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細菌的快速鑒定，本法對于迅速5．VP試驗

原理：測定細菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力。某些細菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧形成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進而與培養(yǎng)基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結(jié)合形成紅色化合物。即V-P試驗陽性。

方法：將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，輕輕振搖試管，然后加0.2ml400g/LKOH，輕輕振搖試管30s至1min，然后靜置觀察結(jié)果。122PPT課件5．VP試驗

41PPT課件

結(jié)果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為陰性123PPT課件結(jié)果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為陰性42PPT課

應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本試驗常與MR試驗一起使用，一般情況下，前者為陽性的細菌，后者常為陰性，反之亦然。124PPT課件應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本試6．膽汁七葉苷水解試驗

原理：在10%~40％膽汁存在下，測定細菌水解七葉苷的能力。七葉苷被細菌分解生成的七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物。

方法：將被檢菌接種于膽汁七葉苷培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h后，觀察結(jié)果。

結(jié)果：培養(yǎng)基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。

應(yīng)用：主要用于鑒別腸球菌與其他鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如脆弱擬桿菌等）的初步鑒別。腸球菌本試驗為陽性。125PPT課件6．膽汁七葉苷水解試驗44PPT課件（二）細菌對于蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗

1.明膠液化試驗

原理：某些細菌可產(chǎn)生一種胞外酶-明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。方法：將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于22℃培養(yǎng)7d，逐日觀察結(jié)果。若用35℃孵育，因明膠在此溫度下自行液化，故在觀察結(jié)果前，先置4℃冰箱內(nèi)30min，再看結(jié)果。126PPT課件（二）細菌對于蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗45PPT課件

結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。應(yīng)用：腸桿菌科細菌的鑒別，如沙雷菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、陰溝桿菌等可液化明膠，而其他細菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。127PPT課件結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。46PPT課件陰性陽性128PPT課件陰性陽性47PPT課件2.吲哚（靛基質(zhì)）試驗

原理：某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)），當(dāng)加入吲哚試劑（對二甲氨基苯甲醛）后則形成紅色的玫瑰吲哚。培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)24～48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑。結(jié)果：于兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。129PPT課件2.吲哚（靛基質(zhì)）試驗48PPT課件130PPT課件49PPT課件3.硫化氫試驗

原理：某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛或亞鐵離子則形成黑褐色的硫化鉛或硫化鐵沉淀。此試驗可間接檢測細菌是否產(chǎn)生硫化氫。培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。方法：將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。131PPT課件3.硫化氫試驗50PPT課件

結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮?。?yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。如沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬細菌，絕大多數(shù)硫化氫陽性，其他菌屬陰性。沙門菌屬中也有硫化氫陰性菌種。132PPT課件結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?1PPT課件133PPT課件52PPT課件4.尿素分解試驗

原理：某些細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)18～24h觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮?。?yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽性。另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。134PPT課件4.尿素分解試驗53PPT課件陽性陰性陰性135PPT課件陽性陰性陰性54PPT課件5.苯丙氨酸脫氨酶試驗

原理：某些細菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基。方法：將被檢菌濃厚接種于苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于35℃培養(yǎng)18～24h，滴加10％三氯化鐵試劑3～4滴，自斜面上方流下。136PPT課件5.苯丙氨酸脫氨酶試驗55PPT課件

結(jié)果：出現(xiàn)綠色為陽性。應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長反應(yīng)時問會引起褪色。加氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色為陽性137PPT課件結(jié)果：出現(xiàn)綠色為陽性。應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長反應(yīng)時問會

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和摩根菌屬細菌均為陽性，腸桿菌種中其他細菌均為陰性。138PPT課件應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威6.氨基酸脫羧酶試驗

原理：具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿。使指示劑顯示出來。培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基。方法：將被檢菌分別接種于賴氨酸（或鳥氨酸或精氨酸）培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基中，并加入無菌液體石蠟或礦物油，于35℃培養(yǎng)1～4d，每日觀察結(jié)果。139PPT課件6.氨基酸脫羧酶試驗58PPT課件

結(jié)果：孵育后，對照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色（指示劑為溴甲酚紫）為陽性；若測定管呈黃色為陰性。若對照管呈現(xiàn)紫色則試驗無意義，重新做試驗。氨基酸對照鳥氨酸賴氨酸鳥氨酸為陽性賴氨酸為陰性氨基酸對照140PPT課件結(jié)果：孵育后，對照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色（指示劑為

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。如沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其余沙門菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。141PPT課件應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。如沙門菌屬中除傷寒（三）碳源和氮源利用試驗

1.枸櫞酸鹽利用試驗

原理：某些細菌能以銨鹽為唯一氮源，并且利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽，使培養(yǎng)基變堿性。培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基。方法：將被檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)1～4d，每日觀察結(jié)果。142PPT課件（三）碳源和氮源利用試驗61PPT課件

結(jié)果：培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{色為陽性；不能利用枸櫞酸鹽作為碳源的細菌，在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基則不變色，為陰性。143PPT課件結(jié)果：培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{色

應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。在腸桿菌科中埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常為陽性。144PPT課件應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。在腸桿菌科中埃希菌2.丙二酸鹽試驗原理：丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細菌鑒定中的一個鑒別性特征。許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，抑制了三羧酸循環(huán)。培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基接種：用幼齡菌種接種測定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫培養(yǎng)1～2d，觀察培養(yǎng)基變色情況。觀察結(jié)果：如測定培養(yǎng)基生長并變藍色，表示可利用丙二酸鹽，為陽性結(jié)果；如測定培養(yǎng)基未變色，則為陰性，即不利用丙二酸鹽。145PPT課件2.丙二酸鹽試驗64PPT課件2.丙二酸鹽利用試驗

（1）原理：有的細菌可利用丙二酸鹽作為唯一碳源，將丙二酸鹽分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。（2）培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基。（3）方法：將被檢菌接種于上述培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。（4）結(jié)果：培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{色為陽性，顏色無變化為陰性。（5）應(yīng)用：腸桿菌科中屬間及種的鑒別?？死撞鷮贋殛栃?，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬中有些菌種也呈陽性，其他菌屬均為陰性。146PPT課件2.丙二酸鹽利用試驗65PPT課件（四）氧化酶試驗

原理：氧化酶（細胞色素氧化酶）是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。試劑：1%鹽酸四甲基對苯二胺或1%鹽酸二甲基對苯二胺。方法：

1.菌落法直接滴加試劑于被檢菌菌落上。

2.濾紙法取潔凈濾紙一小塊，沾取菌少許，然后加試劑。

3.試劑紙片法將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。147PPT課件（四）氧化酶試驗66PPT課件

結(jié)果：細菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈（二甲基對苯二胺鹽酸鹽為紫紅色，四甲基對苯二胺鹽酸鹽為藍色）為陽性。分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應(yīng)。148PPT課件結(jié)果：細菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈（二甲基對苯二胺鹽酸（五）觸酶試驗原理：具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣