肉毒梭菌及其毒素檢驗主講人：王福紅動物性食品微生物檢驗

知識目標(biāo)：

理解肉毒梭菌的生物學(xué)特性。了解肉毒梭菌及其毒素的致病性。掌握肉毒梭菌及其毒素標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法。

能力目標(biāo)：

會制備肉毒梭菌及其毒素檢驗用培養(yǎng)基。會對肉毒梭菌及其毒素進(jìn)行檢驗。

肉毒梭菌肉毒梭菌是一種腐物寄生菌，在自然界分布很廣，土壤、霉干草和畜禽糞便中均有存在，可分為A至G七個型。肉毒中毒是一種較嚴(yán)重的食物中毒，它是肉毒梭菌的外毒素所引起的。早在18世紀(jì)末以前，在德國引起中毒的食品主要是臘腸，所以稱為臘腸中毒（BotuLism）。在我國過去譯為臘腸中毒，把肉毒梭菌譯為臘腸桿菌或臘腸梭菌，現(xiàn)在改稱為肉毒梭菌。引起肉毒中毒主要是食入含有肉毒毒素的食品，食品在調(diào)制加工、運(yùn)輸貯存的過程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在適宜條件下，發(fā)芽、增殖并產(chǎn)生毒素所造成的。國外引起肉毒中毒的食品多為肉類及各種魚、肉制品、火腿、臘腸以及豆類、蔬菜和水果罐頭。中毒食品種類往往與飲食習(xí)慣有關(guān)。如歐洲各國主要的中毒食品為火腿、臘腸和其他獸肉、禽肉等。美國主要是家庭制的水果罐頭，而火腿、臘腸等畜禽肉加工食品僅占7.7%，日本和俄羅斯等國家魚制品中毒者最多，尤其是日本，幾乎全部是魚制品的E型中毒。國內(nèi)因肉類食品及罐頭食品引起的中毒的較少，據(jù)有關(guān)資料調(diào)查統(tǒng)計，主要是臭豆腐、豆鼓、面醬、紅豆制品、爛土豆等植物性食品引起的中毒多見。肉毒梭菌的抵抗力一般，但其芽胞的抵抗力很大，可耐煮沸1～6小時之久，于180℃干熱5～15分鐘才能破壞，120℃高壓蒸氣下10～20分鐘才能殺死。10%鹽酸須經(jīng)1小時才能破壞。在酒精中能存活2個月。其中以A、B型菌的芽胞抵抗力最強(qiáng)。這一點(diǎn)對于罐頭食品的滅菌很重要，若芽胞深藏于食品中，或者數(shù)量過多，雖經(jīng)高溫滅菌，有時也不易殺死芽胞，故應(yīng)特別注意。肉毒毒素抵抗力也較強(qiáng)，80℃30分鐘或100℃10分鐘才能完全破壞。正常胃液和消化酶于24小時不能將其破壞，可被胃腸道吸收而中毒。形態(tài)及染色：本菌為革蘭氏染色陽性的大桿菌，長4～6um,寬0.9～1.2um，多單在，偶見成雙或短鏈。菌端鈍圓。有周身鞭毛，無莢膜，芽胞為橢圓形，A、B型菌的芽胞大于菌體，位于菌體近端，使菌體呈匙形或網(wǎng)球拍狀，另外四型菌的芽胞一般不超過菌體寬度。一、生物學(xué)性狀培養(yǎng)特性：本菌為最嚴(yán)格的厭氧菌，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上都能生長。發(fā)育最適宜溫度為28～37℃，pH為6.8～7.6，產(chǎn)毒的最適pH為7.8～8.2。血清瓊脂：培養(yǎng)48～72小時，形成中央隆起，邊緣不整齊、灰白色、表面較粗糙的絨球狀菌落。直徑可達(dá)6～10mm。血液瓊脂：菌落周圍有溶血區(qū)。血液瓊脂培養(yǎng)特性：普通瓊脂：形成灰白色、半透明、邊緣不整齊。呈絨毛網(wǎng)狀、向外擴(kuò)散的菌落。直徑約為3～5mm。肉渣肉湯：呈均勻混濁生長，肉渣可被A、B和F型菌消化溶解成爛泥狀，并發(fā)黑，產(chǎn)生腐敗惡臭味，從第三天起，菌體下沉，肉湯變清。在肉渣培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基，大量產(chǎn)氣。生化特征本菌生化特性很不規(guī)律，一般能分解葡萄糖、麥芽糖、果糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。對明膠、凝固血清、凝固蛋白均有分解作用，并引起液化。不形成靛基質(zhì)，能產(chǎn)生硫化氫。菌型及毒素目前已知肉毒梭菌有A、B、C、D、E、F、G等7個菌型，其中C型還有Cα和Cβ兩個亞型。引起人群中毒的主要是A、B、E三型，C、D型主要是畜禽肉毒中毒的病原，F(xiàn)型只見報導(dǎo)發(fā)生在個別地區(qū)的人，如丹麥和美國各一起。1980年從瑞士五名突然死亡病例中發(fā)現(xiàn)G型毒素。各型肉毒梭菌產(chǎn)生相應(yīng)型的毒素，所以肉毒毒素也分為A、B、C、D、E、F、G等7型，C型包括Cα和Cβ兩個亞型。肉毒毒素是在肉毒梭菌胞漿中產(chǎn)生，由菌體釋放到培養(yǎng)基中，經(jīng)濾過除菌所得濾液即為毒素液。毒素形成的最適宜溫度為28～37℃，溫度低于8℃與pH在4.0以下時，則不能形成。肉毒梭菌產(chǎn)生的毒素是一種神經(jīng)毒素，是目前已知的化學(xué)毒物與生物毒素中毒性最強(qiáng)的一種，對人的致死量為10-9mg/Kg體重。其毒力比氰化鉀還要大一萬倍。二、致病性肉毒毒素是一種與神經(jīng)親和力較強(qiáng)的毒素，肉毒毒素經(jīng)腸道吸收后，作用于外周神經(jīng)肌肉接頭，植物神經(jīng)末梢以及顱腦神經(jīng)核，毒素能阻止乙酰膽堿的釋放，導(dǎo)致肌肉麻痹和神經(jīng)功能不全。在臨床上表現(xiàn)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀為主，肉毒毒素中毒潛伏期長短不一，短者2小時，長者可達(dá)數(shù)天，一般為12～24小時。中毒癥狀，早期為瞳孔放大、明顯無力、虛弱、暈眩，繼而出現(xiàn)視覺不清和霧視，愈來愈感到說話和吞噬困難，通常還可見到呼吸困難，體溫一般正常，胃腸道癥狀不明顯。病程一般為2～3天，也有的長達(dá)2周之久。肉毒中毒死亡率較高，據(jù)報導(dǎo)可達(dá)30%～50%，死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌瘓癱。如早期使用型特異或多價抗血清治療，死亡率可降至10%～15%。三、檢驗方法《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)—食品衛(wèi)生檢驗方法（微生物學(xué)部分）》肉毒梭菌及其毒素的檢驗方法GB4789.12-2003

?！吨腥A人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》食品中肉毒梭菌的PCR檢測方法SN/T2525-2010

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檢驗方法（GB4789.12）肉毒梭菌檢出分離培養(yǎng)結(jié)果報告肉毒毒素檢驗（一）肉毒毒素檢驗樣品的處理123毒力測定4定型試驗5

檢出試驗

確證試驗液體檢樣可直接離心，固體或半流動檢樣須加適量（例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡、研碎，然后，取上清液進(jìn)行檢測。另取一部分上清液，調(diào)pH6.2，每份加10%胰酶（活力1：250）水溶液1份，混勻，不繼輕輕攪動，37℃作用60min，進(jìn)行檢測。1.樣品的處理試驗方法：取樣品處理完的上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠三只，每只0.5mL，觀察4d。結(jié)果觀察：注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h內(nèi)發(fā)病死亡。如遇小鼠猝死以至癥狀不明顯時，則可將注射液做適當(dāng)稀釋，重做試驗。主要癥狀為豎毛、四肢癱軟，呼吸困難，呼吸呈風(fēng)箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最終死于呼吸麻痹。2.檢出試驗結(jié)果判定：若注射加診斷血清與煮沸加熱的兩份混合液的小白鼠均獲得保護(hù)存活。注射未經(jīng)其他處理的混合液的小白鼠以特有的癥狀死亡?？膳卸z樣中的肉毒毒素存在，必要時進(jìn)行毒力測定及定型試驗。3.確證試驗不論上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小白鼠發(fā)病、死亡者，取樣分成三份進(jìn)行試驗：一份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清，混勻，37℃作用30min。一份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻，煮沸10min。一份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻即可，不做其他處理。三份混合液分別注射小白鼠各兩只，每只0.5mL,觀察4d。3.確證試驗取已判含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩沖液做成50倍、500倍及5000倍的稀釋液，分別注射小白鼠各兩只，每只0.5mL,觀察4d。根據(jù)動物死亡情況，計算檢樣所含肉毒毒素的大體毒力（MLD/mL或MLD/g）。4.毒力測定按毒力測定結(jié)果，用明膠磷酸鹽緩沖液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10MLD/mL～1000MLD/mL的范圍，分別與各單型肉毒抗診斷液血清等量混勻，37℃作用30min，各注射小白鼠兩只，每只0.5mL，觀察4d。同時以明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清，與稀釋毒素等量混合作為對照。能保護(hù)動物免于發(fā)病、死亡的診斷血清即為檢樣所含肉毒毒素的型別。5.定型試驗（二）肉毒梭菌檢出（增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)）試驗取庖肉培養(yǎng)基三支，煮沸10min～15min，做如下處理：第一支：急速冷卻，接種檢樣均質(zhì)液1mL～2mL；第二支：冷卻至60℃，接種檢樣，繼續(xù)于60℃保溫10min，急速冷卻；第三支：接種檢樣，繼續(xù)煮沸加熱10min，急速冷卻。培養(yǎng)：30℃，5d。觀察結(jié)果：若無生長，可再培養(yǎng)10d。培養(yǎng)到期，若有生長，取培養(yǎng)液離心，以其上清液進(jìn)行毒素檢測試驗，方法同肉毒毒素的檢驗，陽性結(jié)果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。選取經(jīng)毒素檢測試驗證實含有肉毒梭菌的前述增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物（必要時可重復(fù)一次適宜的加熱處理）接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養(yǎng)48小時。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時，菌落及周圍培養(yǎng)基表面覆蓋著特有的虹彩樣（或珍珠層樣）薄層，但G型菌無此現(xiàn)象。根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)挑取可疑菌落，接種庖肉培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)5d,進(jìn)行毒素檢測及培養(yǎng)特性檢查確證試驗