《多聚酶鏈式反應擴增DNA片段》教學設計一、課題目標本課題通過嘗試PCR（DNA多聚酶鏈式反應）技術(shù)的基本操作，使學生體驗PCR這一常規(guī)的分子生物學實驗方法，理解PCR的原理，討論PCR的應用。二、課題重點與難點課題重點：PCR的原理和PCR的基本操作。課題難點：PCR的原理。三、課題背景分析課題背景首先介紹了PCR是一種在體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)，然后說明這一技術(shù)在遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆等方面都有著廣泛的應用，最后指出本課題的目標是了解PCR技術(shù)的基本原理，并嘗試用PCR技術(shù)擴增DNA片段。教師在導入本課題的學習時，可以先讓學生談一談對PCR的認識以及PCR的應用，以激發(fā)學生的學習興趣，然后再說明本課題的目標。四、基礎知識分析與教學建議（一）PCR原理知識要點：1.細胞內(nèi)參與DNA復制的各種組成成分與反應條件；的合成方向；DNA聚合酶的應用。教學建議：理解PCR的原理，需要首先了解細胞內(nèi)參與DNA復制的各種組成成分與反應條件。教師在教學過程中，可以首先引導學生回憶必修2《遺傳與進化》中的有關DNA復制的知識。在此基礎上，學生需要進一步了解DNA雙鏈的方向，能夠區(qū)分DNA的3′端和5′端。此外，學生還需要了解DNA聚合酶的特性，如只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈、而不能從頭合成DNA等。TaqDNA聚合酶的應用，解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化，是一個重要的知識點。教師可以結(jié)合專題2中課題2“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)”Taq細菌的發(fā)現(xiàn)過程，幫助學生加深理解。（二）PCR的反應過程知識要點：PCR的基本步驟及每個步驟所發(fā)生的變化。教學建議：這部分內(nèi)容的教學應以讀圖識圖為主。教科書中圖5-9“PCR反應過程圖解”詳細地描繪了參與PCR的各組成成分；每一輪反應的三個基本步驟──變性、復性和延伸；每一輪中每一個步驟所發(fā)生的變化，即每個步驟所具有的作用。教師在教學中可以請學生在讀圖的同時，結(jié)合教科書中的文字說明來加深理解。當學生遇到難以理解的地方時，教師要及時給予解答。五、實驗案例PCR擴增雙歧桿菌編碼16SrRNA的DNA片段1.雙歧桿菌的培養(yǎng)。本實驗用雙歧桿菌作為實驗材料，需要在實驗前一天培養(yǎng)雙歧桿菌。雙歧桿菌的培養(yǎng)基配方如下。大豆蛋白胨g胰胨g酵母提取物10g葡萄糖10g微量鹽溶液40mL半胱氨酸鹽酸鹽g%（g/100mL）刃天青1mL將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH至。其中，微量鹽溶液的配方如下。CaCl2gMgSO4·7H2OgK2HPO41gKH2PO41gNaHCO310gNaCl2g培養(yǎng)雙歧桿菌24h后，將菌液進行離心，雙歧桿菌將沉淀在試管底部。2．PCR操作。往雙歧桿菌的沉淀中加入mL裂解液（裂解液配方為50mmol/L的Tris-HCl,%的Tween20,1mg/mL的蛋白酶K，pH為），使細胞裂解，釋放出DNA。將裂解液在55℃溫度下加熱孵育3h后，再在95℃溫度下加熱10min，然后立即放入冰水中冷卻。冷卻后離心，將10μL上清液轉(zhuǎn)移到mL的離心管中，然后依次加入10倍濃縮的擴增緩沖液5μL、25mmol/L的MgCl2溶液3μL，20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL，TaqDNA聚合酶1μL(2U/μL)，蒸餾水29μL，兩種引物(25μmol/L)各μL。混勻后按教科書表格中的數(shù)據(jù)設定PCR程序，進行反應。需要說明的是，進行本實驗可以直接購買試劑盒，試劑盒的價格比單獨購買試劑的價格要低，并且包括了PCR所需的所有試劑。但是，試劑盒上往往只標出了試劑號，而沒有標明試劑的名稱，因此購買時要進行詳細的咨詢。如果單獨購買試劑，PCR所需的引物必須委托相關的試劑公司來合成，合成后必須低溫保存，否則引物容易發(fā)生降解。本實驗所用引物的堿基序列如下。引物I5′GGATTCTGGCTCAGGATGAACGG3′引物II5′CCGGGTGCTICCCACTTTCATGG3′(I代表堿基次黃嘌呤,它可以與A、G、C、T中的任何1個堿基配對)。3．PCR產(chǎn)物的檢測。產(chǎn)物的檢測除了可以采用教科書中提供的方法外，還可以采用瓊脂糖凝膠電泳的方法。瓊脂糖凝膠電泳的有關介紹可參見本專題中課題3《血紅蛋白的提取和分離》以及本課題的參考資料，具體操作步驟如下。（1）用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子。（2）配制濃度為1%（1g/100mL）的瓊脂糖凝膠。在錐形瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉，加入適量蒸餾水，在微波爐內(nèi)加熱，使瓊脂糖粉熔化，然后冷卻至60℃，倒入電泳槽中，待其凝固。（3）配制倍的TBE電泳緩沖液100mL。配制方法見本課題的參考資料部分。（4）向電泳槽中緩緩倒入配制好的電泳緩沖液，以沒過膠面2mm為宜。小心移去梳子，注意不要破壞加樣孔。如果樣品孔內(nèi)有氣泡，應設法除去。（5）在DNA樣品中加入相當于樣品倍體積的載樣緩沖液（載樣緩沖液的成分參見本課題中參考資料），混勻后，加入樣品孔內(nèi)。（6）接通電源。一般紅色代表正極，黑色代表負極。DNA樣品是由負極向正極移動，因此要保證靠近加樣孔一端的電極為負極。電壓為1～50V/cm(長度以兩個電極之間的距離計算)。（7）當指示劑移動到凝膠邊緣時，斷開電源，終止電泳。一般200～400個核苷酸長度的PCR產(chǎn)物，在50V電壓下，電泳20～40min即可。（8）將凝膠放入溴化乙錠溶液中染色后，在紫外儀上觀察電泳帶及其位置，判斷擴增產(chǎn)物的情況。六、課題成果評價DNA片段的擴增是否成功檢測DNA片段的擴增情況，既可以采用教科書中提供的方法，也可以采用教師用書中實驗案例提供的方法。對于教科書中的方法，可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果；對于電泳檢測的方法，可以通過在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。如果擴增不成功，則要分析失敗原因。可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當?shù)?。七、答案和提示練?.提示：繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR反應中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應循環(huán)次數(shù)。一個DNA片段在30次循環(huán)后反應物中大約有10億個這樣的片段（2n=230=1073741824)。2.提示：PCR引物是根據(jù)需要擴增的目標DNA的堿基序列來設計的。引物的設計需要豐富的分子生物學實驗經(jīng)驗，感興趣的學生可以參考《分子克隆實驗指南》（見本專題參考書目），書中有詳盡的論述。八、參考資料1.瓊脂糖凝膠濃度與DNA分離范圍的關系凝膠濃度要依據(jù)DNA分子的大小來確定。編碼雙歧桿菌16srRNA的DNA片段大小約為1500個核苷酸的長度，因此根據(jù)表4-1選用1％（1g/100mL，下同）的凝膠濃度。表4-1瓊脂糖凝膠濃度與DNA分離范圍的關系瓊脂糖凝膠濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(千堿基對，kb)5～601～20～10～7～6～3～22.核酸電泳緩沖液核酸電泳緩沖液有三種，分別是Tris—硼酸(TBE)、Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。在上述三種緩沖液中：TBE與TPE緩沖液容量高，對DNA的分離效果好，但TPE液中含磷酸鹽的濃度偏高，容易使DNA沉淀。TAE液的緩沖容量低，價格較便宜。本實驗選用的是TBE緩沖液。緩沖液中的EDTA可螯合正價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR產(chǎn)物被降解。10倍濃縮的TBE緩沖液配方如下。Tris108gEDTAg硼酸55g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH為～備用，使用時需稀釋10倍。3.核酸電泳的指示劑與染色劑核酸電泳常用的指示劑是溴酚藍，溴酚藍在堿性條件下呈藍紫色。指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液。載樣緩沖液的作用是：能夠增加樣品密度，確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)；能夠在電泳中形成肉眼可見的藍紫色指示帶，從而幫助預測核酸電泳的速度和位置；能夠使樣品呈現(xiàn)藍紫色，使加樣操作更方便。核酸電泳后，需要染色才能在紫外線下觀察到帶型。最常用的染色方法是溴化乙錠染色法。溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，有劇毒，因此操作時要非常小心。EB可嵌入DNA雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，能發(fā)出紅色熒光。染色的方法有兩種。一種是在凝膠電泳液中加入EB，使其終濃度為μg/mL；一種是在電泳后，將凝膠浸入μg/mL的EB溶液中，染色10～15min。當凝膠染色過深時，可以將凝膠放入蒸餾水中浸泡30min后再觀察。的常見問題PCR實驗很容易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。出現(xiàn)假陰性結(jié)果的常見原因有：TaqDNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關以及PCR系統(tǒng)的建立欠妥當；循環(huán)次數(shù)不夠；等等。當實驗中出現(xiàn)假陰性的情況時，應首先在原來擴增的產(chǎn)物中再加入TaqDNA聚合酶，并增加5～10次循環(huán)。為了防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，在選用TaqDNA聚合酶時，要注意用活力高、質(zhì)量好的酶。同時，在提取DNA模板時，應特別注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。盡管TaqDNA聚合酶對模板純度的要求不高，但也不允許有機試劑的污染。