第三章基因工程載體第一節(jié)克隆載體第二節(jié)表達(dá)載體第三節(jié)特殊用途載體DNA：

1）獨(dú)立的一個(gè)包括啟動(dòng)子（promoter)、編碼區(qū)（encodingregion)和終止子（terminator)的基因，or組成基因的某個(gè)元件，一般是不可以進(jìn)入受體細(xì)胞的；

2）采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后，也不容易在受體細(xì)胞內(nèi)維持。所以，通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的DNA分子稱為基因工程載體。

載體

（Vectors）定義：在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體。

載體

（Vectors）多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記pUCMCSAmpr運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件

載體的功能

目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并在其中維持高效表達(dá)，在很大程度上決定于載體。

（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制，ori。

（3）多克隆位點(diǎn)：外源基因插入的單一限制酶位點(diǎn)。

基因工程對(duì)載體的要求（7）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。

（2）有選擇性標(biāo)記Ampr、Tetr、Kanr等。（4）分子量小，可容納較大的外源基因片段。（5）拷貝數(shù)多，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。（6）具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性。大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322結(jié)構(gòu)圖

復(fù)制起點(diǎn)

遺傳標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)

載體

的種類按功能分類

克隆載體克隆一個(gè)基因或DNA片斷表達(dá)載體用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體把一個(gè)基因插入到染色體組中按來源分類

質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體人工染色體載體載體的種類和特征質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例

E.coli環(huán)狀＜8kbpUC18/19,T-載體等

λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，

λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀＜10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體

100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體＞1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲

桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞

和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒第一節(jié)克隆載體1.質(zhì)粒載體（plasimidvectors）2.噬菌體載體（phagevectors）3.柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvectors）4.人工染色體載體（B/Y/HAC）

質(zhì)粒是一種廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的能自主的復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。并不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等）

。

質(zhì)粒的生物學(xué)特性（1）質(zhì)粒的概念

差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到200kb。質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞中“友好”地“借居”，它可以賦予寄主一些非染色體控制的遺傳性狀，以利于寄主的生存。比如，對(duì)抗菌素的抗性，對(duì)重金屬的抗性等。（2）質(zhì)粒的大?。?）質(zhì)粒的生存

質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制。質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系。根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：

嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringentplasmid）

(拷貝數(shù)少，為1-5個(gè))

松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（relaxed）

(拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個(gè)拷貝)（4）質(zhì)粒的自主復(fù)制性因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。

兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性。具有不相容性的質(zhì)粒組成的群體稱為不相容群，一般具有相同的復(fù)制子。（5）質(zhì)粒的不相容性（6）質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性

在天然條件下，很多天然質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)，這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的tra基因產(chǎn)物。

Conjugativeplasmid接合型質(zhì)粒（自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒）：質(zhì)粒可從一個(gè)細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。

NonConjugativeplasmid非接合型質(zhì)粒（不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒）：由于失去控制細(xì)菌配對(duì)和自我轉(zhuǎn)移的基因，質(zhì)粒不能從一個(gè)細(xì)胞自發(fā)的轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。基因工程一般只能利用非接接合型質(zhì)粒，保證分子操作過程中質(zhì)粒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。TraproteinfromconjugativeplasmidbomsiteMobgenemobmRNAMobproteinopenrecipientcellhelperplasmid

即mob基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的bom位點(diǎn)(oriT位點(diǎn))，借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒被動(dòng)遷移到受體細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為遷移作用(mobilization)。大腸桿菌接合（conjunction）質(zhì)粒DNA的tra基因

E.Coli產(chǎn)生菌毛宿主與受體細(xì)胞結(jié)合遺傳物在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移（指令）（遷移）（7）攜帶特殊的遺傳標(biāo)記

野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物

物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿

這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義

定義:在基因工程中使用與選擇重組體DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因

1.指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞

2.指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子

遺傳標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用1.抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr

，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr

，Neorb.重金屬抗性基因:Cur

，Znr

，Cdrc.代謝抗性基因:TK，抗除草劑基因2.營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3.生化標(biāo)記基因其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ，GUS，CAT4.噬菌斑標(biāo)記基因的種類

質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種。雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）（8）質(zhì)粒的存在形式質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率

同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL天然質(zhì)粒的局限性天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。人工組建的質(zhì)粒

人工組建的質(zhì)粒的第一個(gè)字母是質(zhì)粒英文名字（plasmid）的第一個(gè)字符p，用小寫。p后有2個(gè)字母是大寫，表示質(zhì)粒的作者和實(shí)驗(yàn)室名稱，再其后為質(zhì)粒的編號(hào)。如pBR322，字母p代表質(zhì)粒，BR是構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員的姓名，322代表…構(gòu)建的一系質(zhì)粒的編號(hào)。質(zhì)粒載體的命名原則

第一階段（1977年前）天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,ColE1,pCR,pBR313和pBR322。

第二階段增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。

第三階段完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。質(zhì)粒載體的發(fā)展概況質(zhì)粒載體的構(gòu)建5.根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件質(zhì)粒構(gòu)建基本策略1.加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于選擇轉(zhuǎn)化體2.增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組3.縮短長度，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量4.改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝7、達(dá)到預(yù)期目的前提下，構(gòu)建過程應(yīng)力求簡單1、選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒:Ori、選擇標(biāo)記、MCS2、正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒載體的元件：酶切、PCR3、組裝合適的選擇標(biāo)記基因4、選擇合適的啟動(dòng)子5、提高外源DNA的容量6、需要滅活初始質(zhì)粒上的某些編碼基因質(zhì)粒構(gòu)建原則質(zhì)粒載體：作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備復(fù)制的起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點(diǎn)等部分。

人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：

高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因

低拷貝質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10表達(dá)某些毒性基因

溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)

測序質(zhì)粒含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker

整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)便于外源基因的整合

穿梭質(zhì)粒裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆

表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件

探針質(zhì)粒裝有報(bào)告基因便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選質(zhì)粒載體的分類（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1、pMB9

松弛型質(zhì)粒。具有低分子量、高拷貝數(shù)的優(yōu)點(diǎn)。具有氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)：每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)1000－3000個(gè)！用途：適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。質(zhì)粒載體的分類（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體由pSC101派生來的載體。特點(diǎn)是拷貝數(shù)低。pLG338、pLG339等適合于克隆含量過高對(duì)寄主代謝有害的基因。減少蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞的毒害。（3）溫控的質(zhì)粒載體一些低拷貝基因是溫度敏感型，如pBEU1、pBEU2溫度低（<37oC），拷貝數(shù)很少；

溫度增加（>40oC），拷貝數(shù)很快增加到>1000個(gè)。（4）

插入失活型質(zhì)粒載體

載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。外源DNA片段插入會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因（如tetr、ampr、cmr等）失活。如pDF41、pDF42、pBR322。抗生素抗性外源DNA無抗生素抗性（5）正選擇的質(zhì)粒載體

可大大降低需要篩選的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，從而減輕實(shí)驗(yàn)的工作量，提高了選擇的敏感性。

質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào)并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體pSC101質(zhì)粒載體天然質(zhì)粒，屬嚴(yán)緊型低拷貝質(zhì)粒。9.09kb。四環(huán)素抗性Tetr。ColE1天然質(zhì)粒，屬松弛型、高拷貝質(zhì)粒，6.6Kb。有氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)，每個(gè)細(xì)胞1000-3000拷貝選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1和對(duì)E1免疫的基因（immE1）colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成噬菌斑。①

colicinE1基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因免疫基因溶菌基因②殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因cea+kil基因產(chǎn)物③

不被其他細(xì)菌的colicinE1所殺死的原因imm基因EcoRI位于E1內(nèi)部，插入外源DNA導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E（ColE1-），但仍表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI

唯一的克隆位點(diǎn)ColicinE1外源DNA無Colicin用對(duì)外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作選擇，操作非常繁雜。pBR322：p:質(zhì)粒；BR：質(zhì)粒兩位主要構(gòu)建者姓氏的第一個(gè)字母；322：實(shí)驗(yàn)編號(hào)人工構(gòu)建載體三個(gè)親本質(zhì)粒：pMB1:出發(fā)質(zhì)粒(ColE1)pSF2124:AmprpSC101:TetrpSF2124pMB1pSC101氨芐青霉素和四環(huán)素抗性24個(gè)單一克隆位點(diǎn)。9個(gè)導(dǎo)致Tetr基因失活3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活pBR322的優(yōu)點(diǎn)①雙抗生素抗性選擇標(biāo)記

抗生素抗性基因的插入失活效應(yīng)是檢測重組體質(zhì)粒的有效方法，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得重組載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。AmpAmp＋Tet不含質(zhì)粒載體含有空質(zhì)粒載體含有重組質(zhì)粒載體pBR322重組克隆的篩選重組克隆的“插入失活”篩選方法

pBR322—→插入在Tetr中，基因型為Tets

、Ampr——→在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長；

pBR322—→插入在Ampr中，基因型為Tetr

、Amps、——→在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生長；而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長的是非重組型。這種在一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源DNA片段，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫插入失活。

氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可1000~3000copies④安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。③高拷貝數(shù)②分子小，克隆能力大長度4363bp，易于純化，可以攜帶6-8Kb的外源DNA片段。⑤具有較多的單一酶切位點(diǎn)（24種）保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點(diǎn)。pBR322的缺點(diǎn)能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識(shí)別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移?、賱h除mob識(shí)別位點(diǎn)（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。PBR322的改進(jìn)pBR325：在pBR322位點(diǎn)上接入一段來自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也帶一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。使EcoRI也成為插入失活型位點(diǎn)。②

改造EcoRI位點(diǎn)pUC系列載體

在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19（1）元件來源c.lacz’基因：大腸桿菌lac操縱子DNA區(qū)段，編碼β-半乳糖苷酶-肽鏈，是LacZ氨基端的一個(gè)片段.載體用于可編碼半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。d.MCS多克隆位點(diǎn)。a.ori來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)b.標(biāo)記基因（ampr）:pBR322的Ampr基因

（2）克隆位點(diǎn)

具有MCS（多克隆位點(diǎn)）區(qū)段：位于lacZ’基因的5’端。10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，但它不破壞該基因功能。

IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，乳糖類似物，又稱為安慰誘導(dǎo)物，可代替乳糖誘導(dǎo)乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，即可誘導(dǎo)lacz’所編碼的半乳糖苷酶氨基末端片段（α－肽）的合成。

x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，為生色底物，半乳糖苷酶+x-gal

藍(lán)色菌落藍(lán)白選擇的原理：α-互補(bǔ)：pUC類載體帶有l(wèi)acz’基因，編碼半乳糖苷酶氨基端片段（α-肽），此片段與宿主細(xì)胞所編碼的羧基端半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，形成有功能的半乳糖苷酶，稱α-互補(bǔ)。菌落藍(lán)白斑選擇的原理：在基因克隆時(shí)，細(xì)菌在含有IPTG和x－gal的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。IPTG誘導(dǎo)質(zhì)粒的lacz’基因產(chǎn)生α-肽，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶的羧基端片段。兩種片段形成有功能的半乳糖苷酶，從而使x－gal水解，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使非重組菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)外源基因插到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，使lacz’失活，不能表達(dá)α-肽，破壞了互補(bǔ)作用，細(xì)胞內(nèi)無有活性半乳糖苷酶，使帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落。互補(bǔ)顯色反應(yīng)

PUC載體的優(yōu)點(diǎn)：

a具有更小的相對(duì)分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，平均每個(gè)細(xì)胞可達(dá)500-700個(gè)拷貝b具有MCS片段，可把具有兩種不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到pUC類載體上。c可以用組織化學(xué)方法檢測重組體（藍(lán)白斑篩選）.pGEM載體總長度為2743bp含有一個(gè)氨卞青霉素抗性編碼基因和一個(gè)lacZ’編碼基因一段含有EcoRI、SatI、KpnI、AvaI、