3初級分離內(nèi)容提要3.1沉淀分級3.2泡沫分離初級分離特點初級分離：從各種原料（菌體發(fā)酵液，細胞培養(yǎng)液，細胞破碎液，及其他各種生物原料）中初步分離和濃縮得到一定濃度的目標產(chǎn)品。初級分離的對象：體積大，雜質(zhì)含量高；初級分離技術(shù)：操作成本低，適于大規(guī)模生產(chǎn)。

沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程。采用沉淀的手段，主要是為了通過沉淀達到濃縮的目的，或者通過沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉積在固體中的非必要成分；其次，沉淀可以將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進一步處理。沉淀方法用于分離純化是有選擇性的，即有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成分。3.1沉淀分級沉淀法

生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，這些就是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些條件的因素都會破壞溶液的穩(wěn)定性。

沉淀法就是采用適當?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，控制溶液的各種成分的溶解度，從而將溶液中的欲提取的成分和其它成分分開的技術(shù)。

沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目前仍廣泛應用在工業(yè)上和實驗室中。

沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不溶性雜質(zhì)及細胞碎片）以后進行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或經(jīng)進一步提純，如透析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小時，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟通常按三步進行：沉淀法操作步驟①首先加入沉淀劑;②沉淀劑的陳化，促進粒子生長；③離心或過濾，收集沉淀物。加沉淀劑的方式和陳化條件對產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響。沉淀法的分類根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：（1）鹽析法；（2）等電點沉淀法；（3）有機溶劑沉淀法；（4）非離子型聚合物沉淀法；（5）聚電解質(zhì)沉淀法；（6）高價金屬離子沉淀法等。除第（3）種有機溶劑沉淀法也能適用于抗生素等小分子外，其他各種方法只適用蛋白質(zhì)等大分子。3.1.1蛋白質(zhì)的表面特性蛋白質(zhì)的溶解行為是一個獨特的性質(zhì)，由其組成、構(gòu)象以及分子周圍的環(huán)境所決定。一般而言，小分子蛋白質(zhì)比大分子蛋白質(zhì)更易溶解。蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。蛋白質(zhì)是兩性高分子電解質(zhì)，主要由疏水性各不相同的20種氨基酸組成。在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢，使親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強。因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。蛋白質(zhì)分子表面的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障⑴蛋白質(zhì)周圍的水化層可以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。⑵蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）因此，可通過降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和雙電層厚度（ζ電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)可以看作是一個表面分布有正、負電荷的球體，這種正、負電荷是由氨基和羧基的離子化形成的，換句話說，該球體是帶有均衡電荷分布的膠體顆粒。因此，蛋白質(zhì)的沉淀，實際上與膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相似。★靜電斥力★吸引力蛋白質(zhì)/膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相似

蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。因溶液是電中性的，水中應有等當量的反離子存在。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。3.1.2鹽析沉淀早在1859年，從血液中分離蛋白質(zhì)，隨后:尿蛋白、血漿蛋白。在蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后會壓縮擴散雙電層、降低ζ電位，即中性鹽既會使蛋白質(zhì)脫水，又會中和蛋白質(zhì)所帶電荷，使顆粒間的相互排斥力失去，在布朗運動的互相碰撞下，蛋白質(zhì)分子結(jié)合成聚集物而沉淀析出。Cohn方程式現(xiàn)在常用Cohn經(jīng)驗式來表示蛋白質(zhì)的溶解度與鹽的濃度之間的關(guān)系：㏒S=β－ＫsＩ

式中S——蛋白質(zhì)的溶解度，g/L;I－一離子強度等于I=1/2∑mizi2;mi——離子i的摩爾濃度；

Zi——所帶電荷；

β——常數(shù)，與鹽的種類無關(guān)，但與溫度、pH和蛋白質(zhì)種類有關(guān);Ks——鹽析常數(shù)，與溫度和PH無關(guān)，但與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)。有時為簡單計，也可以用濃度代替離子強度，則上式成為Cohnx經(jīng)驗式（用濃度代替離子強度）

式中m為鹽的摩爾濃度.用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法⑴在一定的pH值及溫度條件下，改變鹽的濃度（即離子強度）達到沉淀的目的，稱為“Ｋs”分級鹽析法。（Ks鹽析：固定pH,溫度，改變鹽濃度）⑵在一定的離子強度下，改變?nèi)芤旱膒H值及溫度，達到沉淀的目的，稱為“β”分級鹽析法。（β鹽析：固定離子強度，改變pH及溫度。）雖然Cohn公式能夠描述鹽析狀態(tài)下蛋白質(zhì)的溶解度，但它不能體現(xiàn)低鹽濃度（鹽溶狀態(tài)）下蛋白質(zhì)的溶解度。鹽析操作硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑硫酸銨的溶解度在0～30℃范圍內(nèi)變化很小20℃時的飽和濃度約為4.05mol/dm3（534g/dm3)，飽和溶液密度為1.235kg/dm3用1.0dm3水制備硫酸銨的飽和溶液，需加入761g硫酸銨，飽和溶液體積為1.425dm3加鹽方式采用硫酸銨進行鹽析時可按二種方式加入：①直接加入固體(NH4)2SO4粉末，工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；②是加入硫酸銨飽和溶液，在實驗室和小規(guī)模生產(chǎn)中，或(NH4)2SO4濃度不需太高時，可采用這種方式，它可防止溶液局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。用硫酸銨分級鹽析蛋白質(zhì)時，鹽析出某種蛋白質(zhì)成分所需的硫酸銨濃度一般以飽和度來表示。實際工作中將飽和硫酸銨溶液的飽和度定為100%或1。鹽析某種蛋白質(zhì)成分所需的硫酸銨數(shù)量折算成100%或1飽和度的百分之幾，即秒為該蛋白鹽析的飽和度。飽和度可以根據(jù)情況用下述兩種方法計算。

1．飽和硫酸銨溶液法

在蛋白質(zhì)溶液的總體不大，要求達到飽和度在50%以下時，可選用此方法。在已知鹽析出某各蛋白質(zhì)成分所要過到飽和度時，可按下列公式計算出應加入飽和硫酸銨溶液的數(shù)量：

式中：

V0——蛋白質(zhì)溶液的原始體積；

C2——所要達到硫酸銨飽和度；

C1——原來溶液的硫酸銨飽和度；

V——應加入飽和硫酸銨溶液的體積。

將計算所得體積的飽和硫酸銨溶液加入到混合蛋白質(zhì)溶液中，即可達到鹽析的目的。嚴格講，混合兩不同溶液時，混合后的總體積并不等于混合前兩種溶液體積之和，而上式中是按相等于計算的，所以會產(chǎn)生誤差。但實驗證明所造成的誤差一般小于20%，故可忽略不計。

2．固體硫酸銨法

所需達到的飽和度較高，而蛋白質(zhì)溶液的體積又不能再過分增大時，采用直接加入固體硫酸銨的方法。欲達到某到飽和度可按下列公式計算出應加入固體硫酸銨的數(shù)量：是將1L飽和度為C1溶液提高到飽和度為C2時，需要加入固體硫酸銨的重量（g）。G和A為常數(shù)，數(shù)值與溫度有關(guān)?，F(xiàn)在已將達到各種飽和度所需固體硫酸銨的數(shù)量列成表，使用時不需計算可直接從表中查出?，F(xiàn)考慮向1dm3蛋白質(zhì)溶液中加入硫酸銨至某一濃度使蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析操作。由于加入硫酸銨后溶液的體積增大，在20℃下，硫酸銨的摩爾濃度從Ｍ１增大到Ｍ２所需加入的硫酸銨量（克）可由下式計算上式如以飽和度表示，則從S1%增至S2%，需加入克數(shù)為上式上式還可以列成表，更為方便。實際所需(NH4)2SO4的飽和度，需通過試驗決定。對多數(shù)蛋白質(zhì)，當達到85%飽和度時，溶解度都小于0.lmg／L，通常兼顧收率與純度。典型的硫酸銨鹽析過程

最適飽和度是35%~55%204060800100總蛋白目標蛋白質(zhì)上清液濃度飽和度陰陽離子鹽析效果陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+

＞高價陽離子硫酸銨：（1）價廉；（2）溶解度大，穩(wěn)定蛋白質(zhì)；（3）水解變酸；（4）高pH釋氨，腐蝕；（5）殘留產(chǎn)品有影響。鹽析注意事項：（1）穩(wěn)定pH用磷酸緩沖液（2）硫酸銨加入后體積變大（3）選擇飽和度（4）分步鹽析（5）初始蛋白濃度3.1.3等電點沉淀

在低的離子強度下，調(diào)pH至等電點，使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉淀。本法適用于憎水性較強的蛋白質(zhì)，例如酪蛋白在等電點時能形成粗大的凝聚物。但對一些親水性強的蛋白質(zhì)。如明膠，則在低離子強度的溶液中，調(diào)pH在等電點并不產(chǎn)生沉淀。圖3.6表示大豆蛋白的溶解度隨pH的變化情況。（1）適用于疏水性強的蛋白質(zhì)（2）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，同時最低溶解度會有所增大。（3）無機酸通常價格便宜，無毒（4）蛋白質(zhì)對低pH敏感，易失活（5）在調(diào)節(jié)等電點時，如果采用鹽酸、氫氧化鈉等強酸強堿，要注意防止酶的失活或蛋白變性。為了使pH緩慢變動，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。

酶、蛋白質(zhì)、核酸、多糖類生化物質(zhì)的水溶液中加入乙醇、丙酮等水溶性的有機溶劑，它們的溶解度會顯著降低，從溶液中沉淀出來。有機溶劑沉淀的優(yōu)點是：分辨率比鹽析法高，溶劑容易除去并可以回收。缺點是易使酶變性。3.1.4有機溶劑沉淀法

加入有機溶劑使溶液的介電常數(shù)減小，增加酶、蛋白質(zhì)、核酸等帶電粒子之間的作用力，因相互吸引聚合沉淀。有機溶劑的加入也使水的極性減小，使兩性電解質(zhì)在溶液中的溶解度降低。有機溶劑會降低蛋白質(zhì)分子的溶劑化能力，破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)沉淀。有機溶劑沉淀的原理1使用有機溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進行，以減少蛋白質(zhì)的變性。2所用有機溶劑須預先冷卻到-10~-20℃；3有機溶劑要緩緩加入，防止溶液局部升溫。4中性鹽會增加蛋白質(zhì)在有機溶液中的溶解度，溶液中的中性鹽濃度越高，沉淀蛋白質(zhì)所需要的有機溶劑濃度也越大5常用的有機溶劑有乙醇、甲醇、丙酮等。

在有機溶劑-水混合溶劑中蛋白質(zhì)的聚沉非離子型聚合物

聚電解質(zhì)沉淀

金屬離子沉淀

自學3.1.5其它沉淀法3.1.6沉淀生成動力學溶解度是一個平衡特性，但是溶解度值的降低是一個動力學過程。當體系變得不穩(wěn)定以后，分子互相碰撞并產(chǎn)生聚并作用。通常認為相互碰撞由下面幾種運動引起：①熱運動，Bromnian運動；②對流運動，由機械攪拌產(chǎn)生；③差示沉降，由顆粒自由沉降速度不同造成的。沉淀過程６個步驟：(1)初始混合(2)新相生成(3)布朗運動凝集(4)機械碰撞凝集(5)絮體破碎(6)聚集體陳化，在陳化過程中，絮體取得大小和阻力的平衡。沉淀法應用利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純

白蛋白與免疫球蛋白的工藝檸檬酸的生產(chǎn)萃取一沉淀法提取分離茶多酚利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純

白蛋白與免疫球蛋白的工藝檸檬酸的生產(chǎn)檸檬酸生物技術(shù)是工業(yè)和學術(shù)界都感興趣的領(lǐng)域，長期以來檸檬酸生產(chǎn)是發(fā)展工業(yè)生物技術(shù)并促使新老技術(shù)交接的驅(qū)動力之一。加熱到70度標準沉淀法回收檸檬酸流程圖新工藝的主要種類我國從上世紀60年代就開始研究非鈣鹽法的提取工藝，近三、五年取得了實質(zhì)性突破。根據(jù)行業(yè)科技交流刊物的報道，已進行過中試或生產(chǎn)規(guī)模試驗的技術(shù)有三類：（1）是中國科學院和阜陽檸檬酸廠合作的“工業(yè)離子色譜法（ILCS）法”（離色法）；（2）另一種是江南大學的“連續(xù)變溫逆流色譜分離法”（色譜法）；（3）還有天津科技大學的“吸附交換分離法”（吸交法）。兒茶素類化合物是茶多酚的主要成分，其結(jié)構(gòu)式可表示為：萃取一沉淀法提取分離茶多酚茶多酚(1)我國茶葉資源豐富，開發(fā)茶葉的新用途，尤其是利用低檔茶葉或茶葉加工的下腳料來生產(chǎn)茶多酚等精細化學品，實屬科教興農(nóng)、利國利民的有力舉措。(2)茶多酚的提取方法比較多，各有特點。具體采用哪種方法視技術(shù)經(jīng)濟條件和茶葉資源而定。(3)從綠茶葉中提取茶多酚的同時，應盡可能提取茶葉中的咖啡堿和天然色素等，以實現(xiàn)茶葉的綜合利用，以期獲得最好的經(jīng)濟效益。(4)茶多酚作為新型天然抗氧化劑，在食品加工、醫(yī)療保健藥品、日用化學品等方面具有重要的應用。隨著科學研究的深入，其應用領(lǐng)域必將進一步擴大。沉淀法提取茶多酚工藝圖萃取法的一般工藝路線萃取法和沉淀法提取茶多酚工藝圖采用萃取一沉淀法由茶葉中分離提取茶多酚的收率較之于單純的萃取法或沉淀法都要好。提取處理時比較適宜條件為：80％乙醇作為浸提溶劑，萃取回流時間在2h左右。萃取介質(zhì)的pH值在3～4，以ZnCI2作為沉淀劑處理濃縮液，6mol/LHCl對沉淀進行轉(zhuǎn)溶處理。最后得到的茶多酚粗品中含量約在70％，呈棕色結(jié)晶性粉末；精茶多酚中茶多酚含量在85％以上，呈淺黃色結(jié)晶。3.2泡沫分離泡沫分離又稱泡沫吸附分離技術(shù)。早在1915年就開始應用于礦物浮選；但是對離子、分子、膠體及沉淀的泡沫吸附分離是在20世紀50年代末才引起人們的興趣與重視，并逐漸作為一種單元操作加以研究，首先是從溶液中回收金屬離子的課題開始，前期研究了泡沫分離金屬離子的可行性，然后建立了金屬離子與表面活性劑離子之間相互作用的擴散－雙電層理論。20世紀60年代中期，脫除洗滌劑工廠排放的一級污水和二級污水中的表面活性劑－直鏈烷基磺酸鹽和苯磺酸鹽獲得成功。20世紀70年代，進行了染料等有機物與廢水泡沫分離的實驗研究，1977年開始有報道用陰離子表面活性劑泡沫分離DNA、蛋白質(zhì)及液體卵磷脂等生物活性物質(zhì)。如：溶菌酶、白蛋白、促性腺激素、胃蛋白酶、凝乳酶、血紅蛋白、過氧化氫酶、卵磷脂、β－淀粉酶、纖維素酶、D－氨基酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶等等。隨著工業(yè)的發(fā)展，特別是對環(huán)境保護的普通重視和資源綜合利用的要求，泡沫分離的研究工作將不斷擴大范圍，其工業(yè)應用將越來越多。泡沫分離法的分類泡沫分離是以氣泡為介質(zhì)，利用組分的表面活性差進行分離的一種分離方法無泡沫分離是指用鼓泡進行分離，但不一定形成泡沫層，可分鼓泡分餾和溶媒浮選。鼓泡分離是從塔設(shè)備底部通氣鼓泡，表面活性物質(zhì)被氣泡富集并上升至塔頂，和液相主體分離，使溶質(zhì)得到濃縮，液相主體被凈化；溶媒浮選是在溶液頂部置有一種與其互不相溶的溶劑，用它來萃取或富集由塔底鼓出的氣泡所吸附的表面活性物質(zhì)。泡沫分離按分離對象是溶液還是含有固體離子的懸浮液、膠體溶液而分成泡沫分餾(FoamFractionation)和泡沫浮選(FoamFlotation)。泡沫分餾用于分離溶解物質(zhì)，它們可以是表面活性劑加洗滌劑，也可以是不具有表面活性的物質(zhì)如金屬離子、陰離子、蛋白質(zhì)、酶等。但它們必須具有和某一類型的表面活性劑結(jié)合的能力，當料液鼓泡時能進入液層上方的泡沫層而與液相主體分離。由于它的操作和設(shè)計在許多方面可與精餾相類比，所以稱它為泡沫分餾。

泡沫浮選用于分離不溶解的物質(zhì)，按照被分離對象是分子還是膠體，是大顆粒還是小顆粒等等，又可分為:1礦物浮選，用于礦石和脈石離子的分離；2粗粒浮選和微粒浮選，常用于共生礦中單質(zhì)的分離，前者粒子直徑大致1～10mm內(nèi)，后者的粒子直徑為1μm～1mm，處理的對象為膠體、高分子物質(zhì)或礦漿；3粒子浮選和分子浮選，用于分離非表面活性粒子或分子，需要向體系中加入浮選捕集劑與被分離組分形成難溶或不溶物，然后以浮渣形式將其脫除；4沉淀浮選，首先利用改變?nèi)芤旱膒H值或加入某種絮凝劑等方法，使需脫除的粒子形成沉淀，再利用浮選法將沉淀脫除；5吸附膠體浮選，是以膠體粒子作為捕集劑，選擇性吸附所需的溶質(zhì)，再用浮選法除去。泡沫分離技術(shù)除了在選礦方面比較成熟外。在其他方面尚屬開發(fā)階段，命名和分類尚不完善，但由上所述，可以對泡沫分離技術(shù)有大體的了解。泡沫分離原理

泡沫分離過程是利用待分離物質(zhì)本身具有表面活性(如表面活性劑)或能與表面活性劑通過化學的、物理的力結(jié)合在一起(如