第八章動物克隆技術(CloningTechnology)

一、概述

克?。菏侵敢粋€細胞或個體以無性繁殖方式產生遺傳物質完全相同的一群細胞或一群個體。在動物繁殖學中，它是指不通過精子和卵子的受精過程而產生遺傳物質完全相同新個體的一門胚胎生物技術?？寺∮袃煞N方式：（1）胚胎切割

（2）細胞核移植（胚胎細胞核移植、體細胞核移植）1.定義胚胎分割（embryosplitting&bisection）是運用顯微操作系統(tǒng)將哺乳動物附植前胚胎分成若干個具有繼續(xù)發(fā)育潛力的部分，從而獲得同卵孿生后代的生物技術。在胚胎數(shù)一定的情況下，通過胚胎分割可獲得較多的后代，有助于提高動物的繁殖力，增加牛、羊等單胎動物的雙胎率；同時也是細胞核移植、胚胎嵌合、胚胎性別鑒定、基因導入等研究工作的基本操作技術，在畜牧生產、實驗生物學或醫(yī)學上均具有重要意義。常用的胚胎切割方法有兩種,即簡易顯微切割和玻璃針透明帶內切割核移植技術：所謂核移植技術就是利用顯微操作技術將一個細胞的細胞核移植到另一個細胞中，或者將兩個細胞的細胞核（或細胞質）進行交換，從而可能創(chuàng)造無性雜交生物新品種的一項技術。胚胎克?。菏褂玫暮斯w細胞如果來自多細胞階段的胚胎，叫做胚胎克隆。體細胞克?。菏褂玫暮斯w細胞來自動物體，叫做體細胞克隆?？寺〖夹g廣義狹義胚胎分割細胞核移植胚胎細胞核移植體細胞核移植2.理論基礎細胞全能性二、動物克隆的研究簡史（一）胚胎分割的研究簡史早在1904年，Spemann就進行了蛙類2—細胞胚胎的分割實驗，并獲得同卵雙生后代。20世紀30年代，Pincus等首次證明2細胞兔胚的單個卵裂球在假孕受體兔體內可發(fā)育為體積較小的胚泡。1942年，Nicholas證明2細胞兔胚的單卵裂球有發(fā)育為胚胎的能力。Seidel和Tarkowski隨后分別在兔和小鼠上進一步證實了哺乳動物2細胞胚的每一個卵裂球都具有發(fā)育為正常胎兒的“全能性”。1968年，Mullar等將家兔的8細胞胚胎一分為二，移植給受體母兔后，獲得了仔兔。（一）胚胎分割的研究簡史20世紀70年代以來，隨著胚胎培養(yǎng)及移植技術的發(fā)展和完善，哺乳動物胚胎分割取得了突破性進展。1970年，Mullen等通過分離小鼠2—細胞胚胎卵裂球，獲的小鼠同卵雙生后代；1974年，Trounson和Moore分割綿羊胚胎，繁殖出同卵雙生羔羊；1978年，Moustafa將小鼠桑椹胚一分為二，也獲得同卵孿生后代。1979年，Willadsen等通過分離2細胞胚胎的卵裂球，也獲得綿羊同卵雙生后代。（一）胚胎分割的研究簡史20世紀80年代以后，哺乳動物胚胎分割技術進入快速發(fā)展時期。Willadsen等在總結前人經驗的基礎上，創(chuàng)造出一套具有突出特點的毛細管分離法。他們用該法分離綿羊2、4、8細胞期的胚胎，并將30個發(fā)育良好的半胚移給受體，獲得24只羔羊。1981年，Willadsen等又用玻璃細管針對綿羊4細胞期和8細胞期的受精卵進行分離，成功地獲得同卵四羔和同卵三羔。同年，他們又分離牛的8細胞期受精卵，并把26枚發(fā)育良好的四分胚移植給受體，獲得8頭犢牛，其中3頭來源于同一胚胎。（一）胚胎分割的研究簡史1982年，Ozil等把顯微操作儀用于胚胎分割，并將分割后的14枚牛的半胚立刻移植給14頭受體，結果9頭妊娠，其中6頭懷有同卵胚胎。1982年，Williams用顯微手術刀對5.5～7d的牛桑椹胚和早期囊胚進行了分割，然后將28枚半胚移給14頭黃牛子宮角，結果9頭妊娠，其中6頭懷雙犢。1983年，他用同樣的方法分割72枚桑椹胚和早期囊胚，移給144頭受體，72頭妊娠，胚胎的妊娠率達100％。Gatica等（1984）簡化了操作方法，分割較晚的胚胎（桑椹胚或囊胚）分割后立即移植。他們將細胞團從被切開的透明帶內取出，用玻璃針一分為二，再將半胚分別移入備用透明帶中，直接把34枚綿羊半胚移植給17只受體，結果有9只妊娠，其中7只雙胎。（一）胚胎分割的研究簡史胚胎分割研究的逐步深入，胚胎冷凍保存技術逐步完善，促進了胚胎分割技術的發(fā)展和應用。2000年1月schattell等人將胚胎分割技術用于靈長目動物，獲得了經胚胎分割的羅猴Tetra（四的意思）。迄今為止，胚胎分割在小鼠、家兔、綿羊、山羊、牛、馬、豬、猿、猴、人等物種上獲得成功，已經是比較成熟的技術。（一）胚胎分割的研究簡史我國家畜胚胎分割及相關的研究工作，自80年代晚期以后進展也很快。1987年，王建辰、錢菊汾等產生了我國第一頭奶山羊胚胎切割移植同卵雙生羔羊。1988年，譚麗玲等對兔胚胎進行了半胚分割，并獲得仔兔；1989年，江蘇農科院、中科院遺傳所獲得山羊鮮胚分割羔羊；同年，張涌等也獲得了山羊鮮胚和凍胚分割羔羊；1987年，蔣世娥等徒手分割綿羊鮮胚獲得成功；1989年，郭志勤等、羅應榮等均獲得綿羊鮮胚和凍胚分割的同卵雙生羔羊。（一）胚胎分割的研究簡史1995年，馬保華等徒手分割山羊鮮胚獲得成功。1989年，譚麗玲等把奶牛半胚移入黃牛獲得成功；同年，郭志勤等獲得奶牛凍胚和鮮胚分割后代；1996年，柏學進等對奶牛半胚裸露冷凍保存進行研究，并獲得成功。1995年，馮書堂等獲得半胚分割的仔豬。此外，我國的研究人員（余頌東等，1989；羅應榮等，1993；高建明等，1994）也把胚胎分割與胚胎性別鑒定有機結合，推動了胚胎分割的深入研究和推廣。世界首例通過胚胎切割方法克隆的牛國外發(fā)展史年代代表人物動物1952Briggs和Kings非洲豹蛙1975Bromhall家兔1981Illmense和Hoppe小鼠1986Willadsen綿羊1987Prather

牛1988Stice和Robl家兔1989Prather等豬1991Yong等山羊（二）胚胎細胞核移植的研究簡史（三）體細胞核移植的研究簡史1996年第一只成年體細胞克隆羊“多利”誕生1997年一頭用胎盤克隆而成的荷蘭牛亮相。1998年兩頭由母牛細胞克隆而成的小牛在東京出生。一個國際研究小組宣布克隆出了三代實驗鼠2000年曾參與克隆“多利”羊的英國公司培育了第一批克隆豬2001年一頭稀有品種的克隆亞洲牛誕生，兩天后死亡。2002年法國研究人員克隆出兔子。2003年美國科學家推出了一匹克隆騾。愛荷華州的研究人員稱他們克隆出了一頭瀕臨滅絕的爪哇野牛。2004年美國加利福尼亞的一家公司培育出了第一只克隆貓。這只貓后來成為第一只被賣出的克隆寵物。2005年韓國科學家宣布他們培育出了首條克隆狗叫“斯納皮”。三、動物克隆的技術程序1.

核供體動物的選擇與細胞核的獲得2.核受體動物的選擇與細胞核的移出3.供體核的移入及原核的取出4.胚泡的體外試管培養(yǎng)5.代母的選擇與胚泡移入子宮6.克隆動物的體內發(fā)育與出生動物克隆技術的核心是核移植動物核移植技術程序胚胎細胞核移植體細胞核移植細胞核移植的方法體細胞克隆技術的關鍵環(huán)節(jié)體細胞克隆的主要技術程序與胚胎細胞基本克隆相同，主要差別在供體細胞的選擇。隨著克隆技術的發(fā)展和人們對核質關系認識的深入，自然狀態(tài)的G0期細胞（如卵丘細胞）和G1期細胞（胎兒成纖維細胞），可直接移入去核卵母細胞中生產克隆胚胎，并且已在小鼠和牛上獲得成功。羅斯林研究所科學家取一頭普通白綿羊的乳腺細胞，將細胞核移植到一個剔除了細胞核的卵子中，使之融合、分裂、發(fā)育成胚胎，然后移植到第三頭羊的體內?？茖W家共培育277個胚胎，只有多莉成功出生。1996年7月5日，多莉降臨人世。直到1997年2月23日才公布于眾。2003.2.14日蘇格蘭向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫實施了安樂死。由于早衰問題，人們懷疑“多莉是穿著羔羊服裝的老羊”?？傮w效率低1、供體核數(shù)量的局限性

目前，胚胎克隆供體核的最高發(fā)育階段是綿羊的內細胞團細胞，而其他家畜必須用64-細胞或更早階段胚胎作核供體，才能獲得克隆后代。2、受體卵子質量的影響3、核質關系的影響細胞核和細胞質關系不協(xié)調是導致核移植效率低的一個重要因素。4、操作技術的影響

四、動物克隆技術存在的問題與前景（一）胚胎克隆技術存在的問題與前景胚胎克隆與胚胎分割、卵裂球培養(yǎng)相比，大大提高了生產遺傳同質動物的效率。1、在研究動物個體的發(fā)生發(fā)育過程中，胚胎細胞核移植為探索細胞質與細胞核的相互作用和胚胎細胞的分化規(guī)律方面提供了很好的研究手段。2、胚胎克隆技術的完善為體細胞克隆技術發(fā)展將提供有益的借鑒，在體細胞克隆沒有成功的動物中，胚胎克隆依然是理想的無性繁殖技術。（二）胚胎克隆技術的發(fā)展遠景體細胞核移植技術又稱體細胞克隆，它是把分化程度較高的體細胞移入去核卵子中，構建新合子的生物技術。它與胚胎克隆技術相比，有兩大優(yōu)點：第一，同一遺傳性狀供體核的數(shù)量可無限獲得；第二，可通過對供體細胞的改造，加速家畜品種改良或生產轉基因動物。（三）體細胞克隆技術存在的問題與前景1.體細胞克隆技術目前存在的問題（1）結果不穩(wěn)定，效率低（2）后代死亡率高（3）用其他體細胞作供體的探索（4）細胞質遺傳問題（5）供體細胞的保存和細胞周期的影響2.體細胞克隆技術的發(fā)展遠景（1）克隆技術的成功將會大大提高畜牧業(yè)的生產效率，加強瀕危動物的保護力度。（2）克隆與轉基因技術結合將大幅度提高轉基因效率，克服外源基因隨機整合帶來的消極影響。（3）克隆人的胚胎與胚胎干細胞技術結合可能會解決目前人類器官修復和移植過程遇到的免疫排斥和供體不足的難題。當然，克隆技術的濫用也會導致嚴重的社會問題。因此，加強克隆技術管理，引導它朝著人類進步的方向發(fā)展是非常必要的。1．動物資源的種質保存包括地球上頻危動物的挽救等。2．生產移植器官，培育優(yōu)良品種，與轉基因技術相結合研制生物反應器生產基因藥物。3．克隆人。是全世界注目的焦點，有人設計了克隆人的技術路線五、動物克隆的應用六、動物克隆的危險