從生物樣品中分離純化生物大分子第一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日概述1.課題研究背景2.課題研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)3.課題技術(shù)路線4.儀器及試劑5.前期研究基礎(chǔ)或預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果第二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日概述1.課題研究背景2.課題研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)3.課題技術(shù)路線4.儀器及試劑5.前期研究基礎(chǔ)或預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果第三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日1.課題研究背景生物大分子是指生物體內(nèi)廣泛的活性物質(zhì)，分子量上千上萬(wàn)甚至更大，多數(shù)生物大分子為多聚體。由簡(jiǎn)單有機(jī)化合物聚合而成。20世紀(jì)以來(lái)，生物化學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)生物迅猛發(fā)展，實(shí)驗(yàn)室里生物大分子的合成進(jìn)步速度可觀。大分子的分離純化與鑒定一直以來(lái)是生物化學(xué)研究的基礎(chǔ)，是生物化學(xué)工作者的重要基本功。生物大分子廣泛存在于機(jī)體的各類組織中，以蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、多糖為主。諸多生物大分子合成分離和純化已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室走向工廠化，因此生物大分子的相關(guān)技術(shù)尤為重要。第四頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日概述1.課題研究背景2.課題研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)3.課題技術(shù)路線4.儀器及試劑5.前期研究基礎(chǔ)或預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果第五頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日2.課題研究?jī)?nèi)容1.從生物樣品中分離純化生物大分子2.利用分離純化生物大分子方法從肝組織中提取分離鑒定一種酶（該酶含三個(gè)大小不同亞基，pI=6.2。）第六頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日創(chuàng)新點(diǎn)對(duì)該酶的特性結(jié)果及分子量不明確，無(wú)法利用分子量差異分離，但可以利用其等電點(diǎn)完成分離。鑒定過(guò)程中利用SDS電泳技術(shù)可以鑒定亞基情況是否是符合要求。第七頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日概述1.課題研究背景2.課題研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)3.課題技術(shù)路線4.儀器及試劑5.前期研究基礎(chǔ)或預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果第八頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3.課題技術(shù)路線(一）從生物樣品中分離純化生物大分子方法1.提取對(duì)象選擇2.制定提取方案3.文獻(xiàn)查閱和前期預(yù)備性實(shí)驗(yàn)4.生物材料處理5.生物大分子提取方法第九頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日1.提取對(duì)象選擇：確定細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)分子的種類，和目標(biāo)分子的位置。2.制定提取方案：確定一套能夠確定完善分離高純度目標(biāo)分子的方法。3.文獻(xiàn)查閱和前期預(yù)備性實(shí)驗(yàn)：通過(guò)文獻(xiàn)資料掌握四種分子理化性質(zhì)，完善計(jì)劃，確定分離途徑、第十頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日4.生物材料的處理：生物大分子來(lái)源通常為生物組織或微生物菌落，首先需要破碎組織。4.1機(jī)械法：1)研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。2)組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C(jī)將組織打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)(即高速分散器)將組織的細(xì)胞打碎。(植物微生物）第十一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日4.2物理法：1)反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。2)超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長(zhǎng)一些。3)壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高壓下使細(xì)胞懸液通過(guò)一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。4)冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。第十二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日4.3化學(xué)與生物化學(xué)方法：1)自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。2)溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。3)酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細(xì)胞壁分解。4)有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。第十三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日5.生物大分子提取方法5.1.核酸的分離純化分離純化原則：（1）

保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性

意義：遺傳信息全部?jī)?chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。

具體原則：溫度不要過(guò)高；控制pH值范圍(pH值5-9);保持一定離子強(qiáng)度;減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力。（2）

防止核酸生物降解DNA酶抑制劑：金屬離子螯合劑；陰離子型表面活性劑RNA酶抑制劑：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸鹽)；肝素；復(fù)合硅酸鹽；RNase阻抑蛋白；氧釩核糖核苷復(fù)合物第十四頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日5.1.2分離純化的步驟：(1)去除雜質(zhì)：生物樣品內(nèi)常含有大量多糖，脂質(zhì)，蛋白質(zhì)等雜志，利用物理或化學(xué)方法將其除去。(2)濃縮：常用沉淀的方法。其好處是：改變核酸的溶解緩沖液；重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。(3)測(cè)定：一般選用紫外分光光度法或溴乙錠熒光法測(cè)定核酸的含量。(4)保存：目標(biāo)核酸的保存處理第十五頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日5.2脂質(zhì)的分離純化(1)先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取組織按1：20的量和氯仿/甲醇一起組織均漿，分層后在室溫下在搖床中搖動(dòng)15-20分鐘。(2)均漿通過(guò)濾紙過(guò)濾或者離心獲得液體。(3)在離心獲得的液體中加入0.2倍體積的水或者0.9%的生理鹽水，渦旋幾秒鐘混均，然后2000rpm離心得到兩相溶液，如果需要的話用甲醇/水（1/1）的將兩相界面洗一到兩次，洗的過(guò)程不要讓甲醇/水與下層混合。(4)通過(guò)離心和虹吸去掉上層后，下層氯仿相含有脂質(zhì)，如果體積在2-3ml以下則通過(guò)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或在氮?dú)庀聺饪s。(5)二氯甲烷可以替代氯仿，結(jié)果表明二氯甲烷/甲醇能夠取代氯仿/甲醇，因此能夠避免氯仿帶來(lái)的健康、安全和管理問(wèn)題。第十六頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日5.3糖的分離純化5.3.1單雙糖的分離：常見(jiàn)的單、雙糖一般采用合成的方式。制備如下：脫脂→去雜→濃縮→再次去雜→脫色→濃縮→冷卻→結(jié)晶（→進(jìn)一步純化）。5.3.2多糖的分離純化：脫脂：由于多糖被脂質(zhì)包圍，通常用醇或醚回流脫脂。提?。簾崴岱?，微波輔助提取法，超聲輔助法，索氏提取法，醇提法，其它方法（如稀堿液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等）除雜：去除混有的蛋白質(zhì)細(xì)胞色素等。純化：分部沉淀法，鹽析法，季銨鹽沉淀法，柱層析，制備性區(qū)域電泳，膜分離法，金屬絡(luò)合物法，其它方法（如超過(guò)濾法、活性炭柱色譜、LKB柱色譜系統(tǒng)等）第十七頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日5.4蛋白質(zhì)的分離純化5.4.1前處理：破壞生物樣品組織，保證蛋白質(zhì)不失活下完成。粗分級(jí)：選用一套適當(dāng)方法，把蛋白質(zhì)混合物提取液中，所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。細(xì)分級(jí)：樣品進(jìn)一步提純進(jìn)一步分離優(yōu)化：將蛋白精細(xì)分離開(kāi)來(lái)。常用有沉淀，離心。電泳。層析。5.4.5濃縮：常用減壓蒸餾法，空氣流動(dòng)蒸發(fā)蒸餾法，冰凍法，吸收法，超濾法提純。5.4.6干燥與保存：保證蛋白質(zhì)活性下將其干燥保存。第十八頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3.課題技術(shù)路線（二）從肝組織中提取一種酶2.1.生物樣品的選擇2.2生物樣品處理2.3.具體檢測(cè)方法2.4.數(shù)據(jù)處理2.5.質(zhì)量控制方法第十九頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日1.生物樣品的選擇：健康2月齡wistar大鼠原理：由于肝臟內(nèi)酶常和脂類或者糖結(jié)合，故應(yīng)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物饑餓24h處理。保證肝內(nèi)酶的活性和減少不必要雜質(zhì)。第二十頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日2．生物樣品處理：2.1大鼠饑餓24h后處死，分離肝臟組織，切碎，勻漿處理，用32層紗布過(guò)濾得到勻漿液。2.2蛋白酶活性抑制：用苯甲基磺酰氟（PMSF）抑制蛋白酶活性，防止目標(biāo)酶水解。原理：細(xì)胞內(nèi)蛋白酶活性較強(qiáng)，PMSF可和蛋白酶結(jié)合不破壞蛋白酶結(jié)構(gòu)，防止細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解第二十一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日2.3去除核酸：原理：細(xì)胞內(nèi)含有大量核酸，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀劑的選擇需要大量的試驗(yàn)來(lái)選定，已知的有1%~2%的鏈霉素硫酸鹽、PEG、溶菌酶等。這里選用鏈霉素硫酸鹽。第二十二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日2.3去除核酸：1%-2%鏈霉素硫酸鹽，沉淀去除核酸。第二十三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3.1勻漿液的分離：原理：目標(biāo)酶位置未知，假設(shè)存在于基質(zhì)、線粒體、酶體三個(gè)位置，利用差速離心法分離取不同亞細(xì)胞組分。第二十四頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3.1勻漿液的分離：組分的分離：取勻漿液1.5ml在4℃下12000r/min離心15min，EP管內(nèi)液面分三層，分別取中、下層。亞細(xì)胞組分的分離：(1)離心管加0.5ml0.34mol/L蔗糖，下層液體0.5ml輕輕覆蓋在上面，1600r/min離心10min,得到上清①。(2)沉淀加1ml0.25mol/L蔗糖混勻，3500r/min離心10min，得到上清②(3)上清①②混合為線粒體及酶體懸浮液。3.1.2亞細(xì)胞組分處理：用超聲破碎儀破碎處理線粒體及酶體懸浮液。第二十五頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3.2目標(biāo)酶的初步提取：

原理：提取酶的方法有多種，但因?yàn)槊傅男再|(zhì)未知，故使用能分離酶且不損傷酶活性的鹽析法。鹽析法：中性鹽能破壞蛋白分子的表面電荷使蛋白質(zhì)聚沉析出。透析法：析出蛋白質(zhì)因含有大量鹽離子影響純化，故有半透膜透析，離子可以離開(kāi)半透膜，而蛋白質(zhì)分子不可以。第二十六頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3.2目標(biāo)酶的初步提?。?.2.1提取液配置：飽和硫酸銨溶液調(diào)節(jié)PH值至6.2，將酶溶液與提取液混勻。3.2.2酶的提取：將混合液于離心機(jī)3000r/min離心10min，取沉淀物加緩沖溶液溶解，將溶液放入透析袋透析至不再有離子析出。第二十七頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3.3目標(biāo)酶的分離純化：原理：DEAE-纖維素為二乙氨乙基纖維素，是陰離子交換劑。

其原理基于離子交換層析：離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹(shù)脂或纖維素組成。

由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過(guò)提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來(lái)。反之陽(yáng)離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過(guò)逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來(lái)。第二十八頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3.3目標(biāo)酶的分離純化：(1)取DEAE-纖維素，調(diào)節(jié)PH至6.3，進(jìn)行裝柱平衡，用乙酸銨進(jìn)行第一次洗脫。同時(shí)用磺基水楊酸進(jìn)行檢測(cè)，收集第二個(gè)峰的組分。(2)回收DEAE-纖維素，調(diào)節(jié)PH至6.1，再次裝柱平衡,上(1)取得樣品，洗脫，收集第一個(gè)峰的組分。第二十九頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3.4目標(biāo)酶的鑒定：取目標(biāo)酶提取液，進(jìn)行SDS電泳檢測(cè)。(1)樣品煮沸10-15min(2)制電泳膠(3)上樣(4)電泳(5)0.25%考馬斯亮藍(lán)R250染色10-15min(6)脫色處理(7)若出現(xiàn)三個(gè)條帶則確定為目標(biāo)酶，若無(wú)則取線粒體和酶體提取液，如重復(fù)3過(guò)程。第三十頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日4.數(shù)據(jù)處理：根據(jù)MARKER計(jì)算蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。由于蛋白質(zhì)為三個(gè)亞基組成，三個(gè)亞基質(zhì)量和即為蛋白質(zhì)質(zhì)量。SDS電泳分別得到三個(gè)亞基質(zhì)量，即可得到蛋白質(zhì)分子量。第三十一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日5.質(zhì)量控制方法：5.1控制樣品分析5.2比對(duì)第三十二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日概述1.課題研究背景2.課題研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)3.課題技術(shù)路線4.儀器及試劑5.前期研究基礎(chǔ)或預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果第三十三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日4.儀器和試劑試劑：PBS溶液、1%-2%鏈霉素硫酸鹽、苯甲基磺酰氟、飽和硫酸銨溶液、氨水、硫酸、乙酸、蔗糖、磺基水楊酸、DEAE-纖維素、30%PEAG，1.5mol/LTris-HCl(PH8.8),1.9mol/LTris-HCl(PH6.8)，5X電泳緩沖液、100g/L過(guò)硫酸銨溶液，四甲基乙二胺，0.25%考馬斯亮藍(lán)，脫色液。儀器：試管、超速離心機(jī)、常速離心機(jī)、透析袋、電磁攪拌器、蠕動(dòng)泵、玻璃層