分子生物學課件第五章基因表達調控真核生物1第一頁，共五十頁，2022年，8月28日

多細胞真核生物，遺傳信息從細胞核的基因組DNA傳遞到基因編碼的蛋白質均受到多層次的調控。第二節(jié)真核生物基因表達的調控第二頁，共五十頁，2022年，8月28日一、真核生物基因表達的特點

1.細胞具有全能性

全能性：指同一種生物的所有細胞都含有相同的基因組DNA，都有發(fā)育成完整個體的潛能。2.基因表達的時間性和空間性

時間性：個體發(fā)育的不同階段，基因表達的種類和數(shù)量是不同的；空間性：在不同組織和器官中，基因表達的種類和數(shù)量是不同的。第三頁，共五十頁，2022年，8月28日3.轉錄和翻譯分開進行真核生物DNA在核中轉錄生成mRNA，穿過核膜至胞質指導蛋白質合成；轉錄和翻譯不是同步進行的，受多層次調控。

4.初級轉錄產物要經過轉錄后加工修飾初級轉錄產物為核不均一RNA

（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA）第四頁，共五十頁，2022年，8月28日5.不存在超基因式操縱子結構真核生物基因轉錄產物為單順反子。6.部分基因多拷貝某些基因以多拷貝形式存在，如組蛋白和tRNA等，這樣既可滿足細胞的需要，也是表達調控的一種有效方式。第五頁，共五十頁，2022年，8月28日單順反子(monocistron)

編碼一個多肽鏈的DNA的序列區(qū)域，相當于真核細胞的一個基因。第六頁，共五十頁，2022年，8月28日translationtranscriptionmRNADNAProteinPromoterGene3′5′單順反子mRNA

(monocistronicmRNA)第七頁，共五十頁，2022年，8月28日（一）基因組DNA水平的調控1.染色質的丟失

不可逆的調控。線蟲胚胎期：1090個細胞成蟲：959個細胞

131個細胞在發(fā)育過程中發(fā)生凋亡二、真核生物基因表達的調控機制第八頁，共五十頁，2022年，8月28日

2.基因擴增（geneamplification）

當細胞對某種基因產物需要量劇增，單純靠調節(jié)其表達活性不足滿足需要，只有增加這種基因的拷貝數(shù)。不適當?shù)幕驍U增可導致某些疾病的發(fā)生。第九頁，共五十頁，2022年，8月28日3.基因重排（generearrangement）VJCVJCVJC免疫球蛋白IgG基因許多片段發(fā)生重排，為免疫球蛋白分子的多樣性奠定了基礎

指某些基因片段改變原來存在順序而重新排列組合，成為一個完整的轉錄單位。調節(jié)表達產物多樣性。第十頁，共五十頁，2022年，8月28日BCR-ABL融合基因形成示意圖(140kDa)(160kDa)第十一頁，共五十頁，2022年，8月28日4.基因的甲基化修飾

DNA上特定的CpG序列處的胞嘧啶發(fā)生甲基化修飾（5mC）。甲基化程度與基因的表達一般呈反比關系。甲基化程度愈高，基因的表達則降低。去甲基化，基因的表達增加。GCGCGCGCGene第十二頁，共五十頁，2022年，8月28日

DNA甲基化研究分析方法原理：甲基化通過影響染色質的結構而調控基因的轉錄。通過研究啟動子部位的甲基化狀態(tài)來研究基因轉錄活性。方法：選用識別序列相同但酶切位點不同的對甲基化敏感性內切酶對待測序列進行酶切。應用：分析抑瘤基因表達下調的機制；分析組織/發(fā)育階段特異性基因的表達機制。

第十三頁，共五十頁，2022年，8月28日

5.染色質結構對基因表達的調控作用

組蛋白與DNA結合與解離是真核基因表達調控的重要機制之一。

非組蛋白主要作為反式作用因子調節(jié)基因表達。

常染色質中疏松狀態(tài)的活性染色質是基因轉錄前在染色質水平上獨特的調控機制。第十四頁，共五十頁，2022年，8月28日1.轉錄起始復合物的形成2.順式作用元件(cis-actingelement)3.反式作用因子(trans-actingfactor)4.轉錄水平的調控機制（二）真核生物基因轉錄調控

以RNA聚合酶Ⅱ為例第十五頁，共五十頁，2022年，8月28日1.轉錄起始復合物的形成

轉錄起始前復合物(pre-initiationcomplex,PIC)和轉錄起始復合物(transcriptioninitiationcomplex,TIC)的形成。真核生物RNApol不與DNA直接結合，而需要依靠眾多的轉錄因子。

第十六頁，共五十頁，2022年，8月28日2.順式作用元件(cis-actingelement)

指某些能影響基因表達但不編碼新的蛋白質和RNA的DNA序列，按照功能分為啟動子、增強子、負調控元件（沉默子等）。第十七頁，共五十頁，2022年，8月28日

（

1）啟動子(promoter)

在基因轉錄起始位點(+1)及其5′上游近端大約100～200bp以內的一組具有獨立功能的DNA序列。每個元件長度約為7～20bp，是決定RNA聚合酶Ⅱ轉錄起始點和轉錄頻率的關鍵元件。第十八頁，共五十頁，2022年，8月28日

真核Ⅱ類基因的順式作用元件圖

①核心啟動子(corepromoter)

包括“轉錄起始位點”及其上游-25～-30bp處富含TA的典型元件“TATA”盒。核心序列為TATAAAA，功能：確定轉錄起始位點并產生基礎水平的轉錄。

②上游啟動子元件(upstreampromoterelement,UPE)包括通常位于-70bp附近的CAAT盒(CCAAT)和GC盒(GGGCGG），功能：調節(jié)轉錄起始的頻率，提高轉錄效率。第十九頁，共五十頁，2022年，8月28日

（2）

增強子(enhancer)

位于啟動子上游或下游并通過啟動子增強鄰近基因轉錄效率的DNA順序，增強子本身不具備啟動子活性。第二十頁，共五十頁，2022年，8月28日(3)其他元件包括負調控元件和終止子等。負調控元件:沉默子（silencer）或衰減子（dehancer）

真核基因內能抑制基因轉錄的DNA序列，與反式作用因子相互結合而起作用。不受距離和方向的限制，并可對異源基因的表達起作用。第二十一頁，共五十頁，2022年，8月28日終止子

在模板DNA分子的5′端轉錄終止信號。通常具有po1yA尾的基因終止信號為G／T簇，例如在SV40中的AGGTTTTTT序列為終止轉錄調控元件。

第二十二頁，共五十頁，2022年，8月28日3.反式作用因子(trans-actingfactor)

能直接或間接地識別或結合在各順式作用元件8～12bp核心序列上，參與調控靶基因轉錄效率的一組蛋白質。

在結構上含有與DNA結合的結構域。第二十三頁，共五十頁，2022年，8月28日（1）反式作用因子根據(jù)作用方式分為三類：

①通用轉錄因子。普遍存在的轉錄因子。如TATAbox結合因子TFⅡD、GCbox結合因子SP1等。②組織特異性轉錄因子。與基因表達的組織特異性有很大關系。③誘導性反式作用因子?；钚阅鼙惶禺惖恼T導因子所誘導。第二十四頁，共五十頁，2022年，8月28日（2）轉錄因子(transcriptionfactor，TF)

RNA合成起始所必需的因子。TF不依賴RNA聚合酶而獨立地結合DNA，在轉錄過程中促使許多RNA聚合酶分子與啟動子結合。第二十五頁，共五十頁，2022年，8月28日(2)轉錄因子結構DNA結合域轉錄活化域TF結合其它蛋白質結構域（如，二聚化結構域）第二十六頁，共五十頁，2022年，8月28日TFⅢA結構域示意圖TFⅢA肽鏈的指結構域含有9個指，與相應的DNA序列結合，指“尖”可以進入DNA雙螺旋的大溝或小溝。但羧基端不具有指結構，是RNA聚合酶Ⅲ和其它的轉錄因子相互作用的部位。第二十七頁，共五十頁，2022年，8月28日

TATA因子與TATA盒結合，形成穩(wěn)定的轉錄復合物，介導RNA聚合酶Ⅱ分子轉錄。

真核基因開放的轉錄起始復合物的形成圖RNA聚合酶Ⅱ識別并結合以上蛋白質-DNA復合物。形成閉合復合物，DNA雙鏈沒有打開，不能啟動轉錄。轉錄起始因子與RNA聚合酶結合，使DNA部分雙螺旋解開成為開放的轉錄起始復合物，轉錄開始合成RNA。第二十八頁，共五十頁，2022年，8月28日DNA識別結合域：

鋅指（zincfinger）結構

A．Cys2／His2鋅指結構；

B．折疊的Cys2／His2鋅指結構；C．Cys2／Cys2鋅指結構第二十九頁，共五十頁，2022年，8月28日同源結構域（homeodomain，HD）同源盒基因家族各基因間具有一相同的保守序列。所含的至少二個α螺旋中形成“轉折”，第三個α螺旋與DNA大溝相互作用，是同源盒蛋白與DNA結合的主要力量。第三十頁，共五十頁，2022年，8月28日堿性-亮氨酸拉鏈亮氨酸之間相互作用形成二聚體，形成“拉鏈”。肽鏈氨基端20～30個富含堿性氨基酸結構域與DNA結合。DNA結合部位結構域疏水性親水性親水性第三十一頁，共五十頁，2022年，8月28日螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）

含兩個雙性α-螺旋，每3～4個氨基酸含一個疏水性殘基，中間為非螺旋環(huán)區(qū)，內含一個或多個能阻斷螺旋的氨基酸殘基。第三十二頁，共五十頁，2022年，8月28日①酸性α-螺旋（acidicα-helixdomain）能非特異性地與起始復合物（如TATA盒結合因子）相互作用發(fā)揮轉錄活化功能。②富含谷氨酰胺的結構域（glutamine-richdomain）最強的轉錄活化域之一。③富含脯氨酸結構域（proline-richdomain）2)轉錄活化結構域（transcriptionalactivationdomain）第三十三頁，共五十頁，2022年，8月28日3.轉錄水平的調控機制(１)反式作用因子的活性調節(jié)

真核基因轉錄起始的調節(jié)，首先表現(xiàn)為反式作用因子的功能調節(jié)，即特定的反式作用因子被激活后，可以啟動特定基因的轉錄。第三十四頁，共五十頁，2022年，8月28日反式作用因子的激活方式:①表達式調節(jié)②共價修飾

A.磷酸化－去磷酸化。

B.糖基化。③配體結合：(核受體超家族)④蛋白質與蛋白質相互作用第三十五頁，共五十頁，2022年，8月28日（2）反式作用因子作用方式

1）成環(huán)（looping）2）扭曲(twisting)3）滑動(sliding)4）Oozing

反式作用因子與順式元件結合如何影響到遠距離RNA聚合酶結合并影響其調控基因？第三十六頁，共五十頁，2022年，8月28日（3）反式作用因子的組合式調控基因表達的調控不是由單一的反式作用因子完成而是幾種因子組合，發(fā)揮特定的作用。第三十七頁，共五十頁，2022年，8月28日（1）報道基因分析法原理：將調控序列克隆到含有報道基因的表達質粒中,再轉染細胞,通過報道基因的活性可檢測轉錄活性。應用：啟動子活性的檢測常用的報道基因：Luciferase（熒光素酶）、

GFP（綠色熒光蛋白）、

SEAP（分泌性堿性磷酸酶）4.轉錄水平研究方法第三十八頁，共五十頁，2022年，8月28日（2）DNaseⅠ超敏感分析法原理：轉錄活躍區(qū)域對核酸酶作用敏感度增加，經DNaseⅠ消化常出現(xiàn)長短不均一的100－200bp的DNA片段，說明此DNA受組蛋白掩蓋的結構有變化，出現(xiàn)了對DNaseⅠ高敏感點(hypersensitivesite)。方法：用DNaseⅠ處理細胞核DNA，再用合適的內切酶進行消化，電泳分離，轉膜，用靶基因的探針進行southern雜交，根據(jù)片段大小推測基因調控區(qū)的位置。應用：確定基因啟動子內調控區(qū)的位置。第三十九頁，共五十頁，2022年，8月28日（3）足紋法（footprinting)原理：蛋白質結合到DNA序列上，可阻止核酸酶對其的降解。方法：DNA序列與靶蛋白進行孵育，再用DNaseⅠ進行切割，電泳，分析圖譜。應用：確定DNA結合蛋白的識別序列。第四十頁，共五十頁，2022年，8月28日（4）凝膠遷移率（gelshiftassay)

或電泳遷移率實驗（EMSA）

原理：蛋白質與特定的DNA序列結合后，遷移率會發(fā)生改變，DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。方法：純化的蛋白或細胞粗提液和同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，聚丙烯凝膠電泳，放射自顯影。

應用：研究DNA結合蛋白；RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

第四十一頁，共五十頁，2022年，8月28日(三)轉錄后水平的調控1.5ˊ端加帽和3ˊ端多聚腺苷酸化及意義

5ˊ端加帽:真核生物轉錄生成的mRNA在轉錄后，在5ˊ端加上7－甲基鳥苷(m7GPPPmNp-)。

意義:保護轉錄體mRNA不受5ˊ外切酶降解，增強mRNA穩(wěn)定性，有利于mRNA從細胞核向胞質轉運，促進mRNA與核糖體結合（通過帽結合蛋白介導完成）。第四十二頁，共五十頁，2022年，8月28日

3ˊ端加尾:轉錄后在mRNA在3ˊ末端加上50～150個腺苷酸，即poly(A)尾。意義:保證mRNA在轉錄過程中不被降解。第四十三頁，共五十頁，2022年，8月28日2.mRNA前體的選擇性剪接(alternativesplicing)對基因表達的調控作用

（1）mRNA前體的剪接真核細胞基因表達所轉錄出的mRNA前體在剪接酶作用下，有序刪除每一個內含子并將外顯子拼接起來，形成成熟的mRNA，這一過程即為剪接。

第四十四頁