動物細胞工程專題2細胞工程動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合制造單克隆抗體核移植動物細胞工程常用技術(shù)動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)一、動物細胞培養(yǎng)

1.發(fā)展歷史:20世紀(jì)初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)向外突出形成的，還是由神經(jīng)細胞周圍的其他細胞融合而成的。生物學(xué)家們就這個問題展開了激烈的爭論。1907年，美國生物學(xué)家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細胞中長出了神經(jīng)纖維。哈里森的實驗不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問題，而且開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河。此后，在許多科學(xué)家的不懈努力下，動物組織培養(yǎng)不斷改進并逐漸發(fā)展成為動物細胞培養(yǎng)。2.動物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念：

動物細胞培養(yǎng)就是從動物有機體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細胞生長和增殖.3.動物細胞的培養(yǎng)過程取健康動物組織塊剪碎組織胰蛋白酶處理分散成單個細胞——動物細胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動物細胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)制成細胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進行原代培養(yǎng)出現(xiàn)接觸抑制，重新用胰蛋白酶等處理，分散成單個細胞，分瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進行傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)都要放在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)過程：動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液胰蛋白酶10代細胞原代培養(yǎng)50代細胞傳代培養(yǎng)無限傳代單個細胞加培養(yǎng)液遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)已改變（分解彈性纖維）思考討論：在動物細胞培養(yǎng)過程中，為什么要用胰蛋白酶對取出的動物組織進行處理？

動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。胰蛋白酶處理動物組織，可以使動物組織細胞間的膠原纖維和細胞外的其他成分酶解，獲得單個細胞但不破壞細胞結(jié)構(gòu)。有關(guān)概念原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。合成培養(yǎng)基：將細胞所需營養(yǎng)物質(zhì)按其種類和所需數(shù)量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基。4.動物細胞培養(yǎng)的條件①無菌、無毒的環(huán)境②營養(yǎng)③溫度和pH④氣體環(huán)境

5.動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn)如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體健康細胞培養(yǎng)培養(yǎng)健康細胞用于燒傷病人皮膚移植細胞的生理、藥理、病理研究

植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理細胞的全能性細胞增殖培養(yǎng)基性質(zhì)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分植物激素動物血清培養(yǎng)結(jié)果植物體細胞培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒植株獲得細胞或細胞分泌蛋白旁欄思考為什么對動物細胞進行培養(yǎng)時通常要添加血清？血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白。氨基酸有多種，是細胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，其中有些氨基酸動物細胞本身不能合成（稱為必需氨基酸），必須由培養(yǎng)液提供。血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子（如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、類胰島素生長因子等）；血清還含有多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進細胞的生長、增殖和貼附。因此，細胞培養(yǎng)時，要保證細胞能夠順利生長和增殖，一般需添加10%～20%的血清。思考：2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？1、動物細胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？3、為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？4、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動物血清等因為這些組織或器官上的細胞生命力旺盛，分裂能力強成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細胞懸浮液利于培養(yǎng)不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體二、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物

動物核移植是將動物的一個細胞的細胞核,移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中.使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體.1.核移植技術(shù)例1.克隆羊培育過程黑面綿羊去核卵細胞白面綿羊乳腺細胞核細胞核移植重組細胞電脈沖刺激早期胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利供體細胞（供核）細胞培養(yǎng)體細胞卵母細胞（MⅡ中期：供質(zhì)）去核無核卵母細胞注入細胞融合重組細胞構(gòu)建重組胚胎胚胎移植代孕母體生出與供體奶牛遺傳基礎(chǔ)相同的犢牛注意:1.取卵細胞作受體細胞的原因是:它是最大的細胞,易操作,它發(fā)育可直接表達性狀2.嚴(yán)格來說新個體有卵母細胞的細胞質(zhì)所以有兩個親本的性狀核移植技術(shù)：2.體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景1.克隆動物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白。

2.改良動物品種。

3.治療人類疾病，作為供體。

4.保護瀕危動物3.體細胞核移植技術(shù)存在的問題1.許多克隆動物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。2.成功率非常低及克隆動物食品的安全性問題。1.在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體細胞的核?為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物提供的體細胞，在供體細胞的細胞核移至受體細胞之前，必須將受體細胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐摹?.用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細胞，為什么？培養(yǎng)的動物細胞一般當(dāng)傳代至10~50代左右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，其細胞遺傳物質(zhì)可能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細胞核移植中，為了保證體細胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細胞。3.你認為用上述體細胞核移植的方法生產(chǎn)的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復(fù)制嗎？為什么？克隆動物絕大部分DNA來自于供體細胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來自于受體卵母細胞。所以，用教材中所述的方法克隆的動物不是供核動物完全相同的復(fù)制。此外，即便動物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動物的一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系，核供體動物生活的環(huán)境與克隆動物所生活的環(huán)境不會完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物不會是核供體動物100%的復(fù)制。討論：2.動物細胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化的過程嗎？為什么？脫分化又稱去分化，是指分化細胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只毎匦缘倪^程。植物的任何一部分，甚至單個細胞都具有長成完整植株的能力。但要發(fā)育成完整植株，必須先脫分化，脫分化的細胞具有發(fā)育成任何組織的能力，然后進行再分化，形成完整植株。植物細胞培養(yǎng)主要用于農(nóng)林生產(chǎn)中的作物、苗木育種，快速繁育種苗、培育無病毒植株等，這就要求植物的組織或細胞先進行脫分化。動物細胞的培養(yǎng)有各種用途，一般而言，動物細胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化的動物細胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細胞也就沒有類似植物組織或細胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動物干細胞，使其分化成所需要的組織或器官。1.幼齡與老齡動物的組織細胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？細胞的衰老與動物機體的衰老有著密切的關(guān)系，細胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動物細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物則相反。所以，一般來說幼年動物的組織細胞比老年動物的組織細胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細胞的分化程度越低，則增殖能力越強，所以更容易培養(yǎng)。思考與探究3.1997年，美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭名叫盧辛達（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目前世界各國高產(chǎn)奶牛場奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4t。

（1）能利用體細胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達嗎？請說明理由。提示：可以用體細胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達。盧辛達的產(chǎn)奶量很高，說明它有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達的體細胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進程。

但同時需注意，該克隆牛不能無限制地推廣，其數(shù)量不宜過多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。

提示：在研究方面，克隆動物基因組重新編程的機制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問題。這些問題尚在研究中。在應(yīng)用上，生產(chǎn)克隆動物費用昂貴，距大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離。（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達的任務(wù)交給你，你將如何對它進行克??？

提示：首先從盧辛達耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細胞。從屠宰場取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細胞的核，再將耳細胞注入卵母細胞，用電刺激方法使卵母細胞與體細胞融合，這時供體核就進入了受體卵母細胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細胞核的卵母細胞，使其完成減數(shù)分裂和發(fā)育過程。核移植胚胎在體外短時間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。

4.體細胞核移植技術(shù)在研究和應(yīng)用上還存在什么問題？請你查閱資料，了解這方面的前沿動態(tài)。

知識結(jié)構(gòu)動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)動物細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念細胞培養(yǎng)的過程細胞培養(yǎng)的條件細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物核移植技術(shù)和克隆動物的概念體細胞核移植技術(shù)的過程體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景體細胞核移植技術(shù)存在的問題動物細胞融合與單克隆抗體一、動物細胞融合

細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合

受精作用植物體細胞雜交植物細胞A植物細胞B原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜種細胞組織培養(yǎng)雜種植株去細胞壁纖維素酶、果膠酶化學(xué)法物理法篩選動物細胞與植物細胞的差別：無細胞壁全能性受限制，不能發(fā)育成雜種動物動物細胞雜交與植物細胞雜交的不同：不需去除細胞壁不能發(fā)育成新的動物個體細胞A細胞B雜種細胞生物法

滅活的病毒物理法化學(xué)法仙臺病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒動物細胞融合一、動物細胞融合（細胞雜交）1、概念：指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程。2、結(jié)果：形成單核的雜交細胞3、原理：細胞膜的流動性4、誘導(dǎo)方式物理法：離心、振動、電激化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒5、過程：動物細胞A動物細胞B誘導(dǎo)，融合2個完整的雜交細胞AB有絲分裂（膜融合、質(zhì)融合）（核融合）注意：動物細胞的融合也需要把多個兩種細胞放在一起，讓它們隨機融合后，再從中篩選雜交細胞6、意義：突破了有性雜交方法的局限，打破生殖隔離,使遠緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。7、應(yīng)用：成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段

特別是利用雜交瘤技術(shù)制造單克隆抗體植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合細胞融合原理細胞膜的流動性、細胞膜的流動性細胞融合的方法去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合誘導(dǎo)方法物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒用途獲得雜種植株制備單克隆抗體二、單克隆抗體什么是抗體？抗體是機體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。

B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。B淋巴細胞與抗體的關(guān)系

１．B淋巴細胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生特異性抗體。２．動物在免疫反應(yīng)過程中，體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體種類可達百萬種以上，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。

３．但每一個Ｂ淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。

４.在體外，一個Ｂ淋巴細胞是不可能無限增殖的。

單克隆抗體

由單個B淋巴細胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細胞群，這一細胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。

特點：

特異性強、靈敏度高

如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能利用腫瘤細胞無限增殖的特性利用細胞融合的技術(shù)將兩種細胞融合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細胞一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細胞（癌細胞）能無限增殖雜種細胞動物細胞培養(yǎng)技術(shù)1.設(shè)計方案：動物細胞融合創(chuàng)始人：米爾斯坦單克隆抗體既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量繁殖2.單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體動物細胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細胞才能活動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體制備過程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細胞思考：1.本過程利用了哪些技術(shù)？免疫學(xué)、細胞融合技術(shù)、動物細胞培養(yǎng)技術(shù)2.為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體3.植物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合技術(shù)有什么不同？

植物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合技術(shù)基本相同,不同的是植物體細胞融合前需去掉細胞壁,然后再融合;動物細胞融合是兩個體細胞直接融合。4.單克隆抗體的應(yīng)用特點：與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異性強，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯。應(yīng)用主要有：1.臨床診斷:作為診斷試劑：有準(zhǔn)確，高效，快速的優(yōu)點2.作為載體，運載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤

資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆