多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片段第一頁，共三十三頁，2022年，8月28日第二頁，共三十三頁，2022年，8月28日課程標(biāo)準(zhǔn)嘗試PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用。課標(biāo)解讀1.理解PCR技術(shù)的基本原理。2.知道PCR技術(shù)的基本操作過程。3.討論P(yáng)CR技術(shù)的應(yīng)用。

第三頁，共三十三頁，2022年，8月28日1．生物體內(nèi)DNA分子復(fù)制的條件

(1)四種

是合成子鏈的原料。

(2)

提供了DNA復(fù)制的模板。

(3)

打開了DNA雙鏈。

(4)

催化合成DNA子鏈。

(5)

使DNA聚合酶能夠從

開始連接脫氧核苷酸。PCR技術(shù)的原理及反應(yīng)過程

脫氧核苷酸DNA母鏈解旋酶DNA聚合酶引物引物的3′端第四頁，共三十三頁，2022年，8月28日2．PCR擴(kuò)增的原理及條件

(1)概念

PCR即

，是一種

迅速

的技術(shù)。它能以極少量的

為模板，在短時間內(nèi)復(fù)制出上百萬份的

。

(2)原理 ①DNA的熱變性：在

的溫度范圍內(nèi)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解體，雙鏈分開，這個過程稱為

。當(dāng)溫度緩慢

后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新

。 ②子鏈的合成：a.需要

；b.合成方向總是從子鏈的

端向

端延伸。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增DNA片段DNADNA拷貝80～100℃變性降低結(jié)合成雙鏈引物5′3′第五頁，共三十三頁，2022年，8月28日(3)條件①

模板。②分別與模板DNA兩條模板鏈相結(jié)合的兩種

。③A、T、G、C四種

。④耐熱DNA聚合酶，一般用

。⑤需要一定的

和能嚴(yán)格控制

的溫控設(shè)備。DNA引物脫氧核苷酸耐高溫的TaqDNA聚合酶緩沖溶液溫度第六頁，共三十三頁，2022年，8月28日3．PCR反應(yīng)過程

PCR一般要經(jīng)歷

次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為

、

和

三步。

(1)

：當(dāng)溫度上升到

以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。

(2)

：溫度下降到

左右，

通過

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

(3)

：溫度上升到

左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在

的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA

鏈。三十多變性復(fù)性延伸變性90℃復(fù)性50℃兩種引物堿基互補(bǔ)配對延伸72℃DNA聚合酶第七頁，共三十三頁，2022年，8月28日[思維激活1]DNA復(fù)制緣何必須有引物？提示DNA聚合酶不能從頭合成DNA，而只能以3′延伸DNA鏈，故DNA合成時，必須加入引物(其3′游離)以作為延長DNA子鏈的“引子”。第八頁，共三十三頁，2022年，8月28日1．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和細(xì)胞外PCR擴(kuò)增的比較(見下表)項(xiàng)目DNA復(fù)制PCR擴(kuò)增不同點(diǎn)場所細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外能量ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶耐熱的TaqDNA聚合酶是否有轉(zhuǎn)錄伴有轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生引物無轉(zhuǎn)錄、需加入兩種引物特點(diǎn)邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制體外迅速擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制30多次緩沖液不需要需要人為控制設(shè)備無需要嚴(yán)格控制溫度變化的溫控設(shè)備第九頁，共三十三頁，2022年，8月28日相同點(diǎn)原料四種脫氧核苷酸復(fù)制原理嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對原則模板DNA為模板引物都需要與模板相結(jié)合的引物第十頁，共三十三頁，2022年，8月28日2.PCR過程

(1)變性 當(dāng)溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。

(2)復(fù)性 溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。第十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日(3)延伸溫度上升到72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。第十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日特別提醒(1)72℃左右時，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由5′端向3′端延伸。(2)DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使該段固定長度的序列呈“指數(shù)式”擴(kuò)增。第十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日【鞏固1】

標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程一般分為變性、復(fù)性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是 (

)。

A．94℃、55℃、72℃ B．72℃、55℃、94℃ C．55℃、94℃、72℃ D．80℃、55℃、72℃

解析當(dāng)溫度上升到90℃(90～96℃)以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈，稱之為變性；當(dāng)溫度下降到50℃(40～60℃)左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合；當(dāng)溫度上升到72℃(70～75℃)時，溶液中的四種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈，稱為延伸。 答案A第十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日1．實(shí)驗(yàn)用具

(1)PCR儀：該儀器能自動調(diào)控

，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。如果沒有PCR儀，可用3個

代替，操作時按程序在3個

中

PCR反應(yīng)的微量離心管。

(2)微量離心管：總?cè)莘e為

，實(shí)際上是進(jìn)行

的場所。

(3)微量移液器：用于

。PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作及評價

溫度恒溫水浴鍋水浴鍋來回轉(zhuǎn)移0.5mL多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體第十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日2．操作步驟 準(zhǔn)備→

→混合→

→反應(yīng)。3．操作提示

(1)為避免

等因素的污染，實(shí)驗(yàn)中使用的一些用具在使用前必須進(jìn)行

。

(2)所用的

和

應(yīng)分裝成小份，并在

儲存。

(3)在

中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須

。加入組分設(shè)置PCR的循環(huán)程序外源DNA高壓滅菌緩沖液酶－20℃微量離心管更換第十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日[思維激活2]PCR操作中模板DNA是否需解旋？需要旋轉(zhuǎn)酶嗎？提示PCR操作中，模板DNA仍需解旋，但該解旋過程不是DNA解旋酶催化的結(jié)果，而是利用DNA熱變性的原理，在80～100℃溫度范圍內(nèi)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，以此達(dá)到解旋的目的。第十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日1．PCR儀：PCR自動化程度較高，參照下表設(shè)計(jì)程序即可。循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第1次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min第十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日(將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s。目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部)

第十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日第二十頁，共三十三頁，2022年，8月28日3．實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測定

DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)?？梢岳肈NA這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測定，具體方法如下： ①稀釋：2μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋 ↓ ②對照調(diào)零：以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零 ↓第二十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日③測定：取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值↓④計(jì)算：DNA含量(μg)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)特別提醒若沒有PCR儀，可進(jìn)行水浴擴(kuò)增DNA設(shè)置3個恒溫水浴鍋，溫度分別為94℃、55℃和72℃，在3個水浴鍋中依據(jù)PCR儀的處理時間來回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管即可。第二十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日【鞏固2】

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，其簡要過程如圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)敘述不正確的是(

)。

A．PCR技術(shù)是在實(shí)驗(yàn)室中以少量DNA制備大量DNA的技術(shù)

B．反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板

C．PCR技術(shù)中以核糖核苷酸為原料，以指數(shù)方式擴(kuò)增

D．應(yīng)用PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測基因突變第二十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日解析PCR技術(shù)是人工合成DNA的方法，原料是脫氧核苷酸而不是核糖核苷酸。答案C第二十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日【例1】

(2011江蘇)請回答有關(guān)問題。

(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。PCR技術(shù)的原理

第二十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日①從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為________。②在第______輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。第二十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日①第1組：________________；②第2組：________________。(3)PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)開________________。第二十七頁，共三十