腎素原受體系統(tǒng)在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用,中醫(yī)眼科論文糖尿病性視網(wǎng)膜病〔diabeticretinopathy,DR〕是糖尿病性微血管病變中最常見的并發(fā)癥，也是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。糖尿病視網(wǎng)膜病變的病因復(fù)雜，至今發(fā)病機制不明。糖尿病視網(wǎng)膜病變主要以氧化作用造成視網(wǎng)膜的損傷，8-羥脫氧鳥苷〔8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG〕能夠標(biāo)記氧化應(yīng)激損傷，通過免疫組化法能夠檢測出8-OHdG的表示出。研究[1]顯示，腎素血管緊張素系統(tǒng)〔rennin-angiotensinsystem,RAS〕的激活是DR發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險因素，阻斷RAS系統(tǒng)能夠抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。慢性高血糖能夠激活RAS在眼內(nèi)發(fā)揮作用進(jìn)而導(dǎo)致DR的進(jìn)一步發(fā)展。血管緊張素Ⅱ是RAS的主要效應(yīng)分子，其通過收縮血管的作用強效升高全身和局部血壓，研究[2]顯示血管緊張素Ⅱ受體〔angiotensinⅡreceptors2,AT2R〕也存在于視網(wǎng)膜及其他眼內(nèi)組織。腎素原受體[〔pro〕renninre-ceptor,PRR]為RAS系統(tǒng)成員之一。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶〔extracellularsignal-regulatedkinase,ERK〕分為ERK1和ERK2,統(tǒng)稱為ERK1/2,被激活后進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)某些基因的轉(zhuǎn)錄和表示出，與細(xì)胞的增殖分化有關(guān)。CD14和8-OHdG免疫組化染色了解新生血管的產(chǎn)生和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡的情況，該實驗旨在通過觀察不同病程糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜中AT2R的含量以及ERK1/2、磷酸化ERK1/2〔p-ERK1/2〕蛋白的表示出及CD14、8-OHdG的表示出，了解RAS系統(tǒng)在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用。1材料與方式方法1.1實驗動物健康雄性SD大鼠50只，普通級，2月齡，19020g,由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，隨機分為正常組〔10只〕和糖尿病組〔38只〕。實驗期間各組大鼠均自由飲水和進(jìn)食〔普通飼料喂養(yǎng)〕。1.2主要試劑及儀器鏈脲佐菌素〔streptozocin,STZ〕購自美國Sigma公司；ERK1/2單抗和兔抗磷酸化ERK1/2多抗購自美國SantaCruz公司；TR-Izol、MMLV購自美國GibcoBRL公司；內(nèi)參-actin單抗購自武漢博士德公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。1.3糖尿病大鼠模型建立適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，1周后將〔20020〕g的48只大鼠作為研究對象，血糖檢測均正常。根據(jù)文獻(xiàn)[3],大鼠一次性單劑量腹腔注射STZ50mg/kg溶于檸檬酸鹽緩沖液中〔臨用前以1∶1混合檸檬酸與檸檬酸鈉，pH4.5〕，對照組給予等劑量檸檬酸鹽緩沖液；48h后采用羅氏血糖儀測定尾靜脈血糖，血糖16.9mmol/L以為糖尿病模型建立成功。模型建立后觀察1周后測量血糖，將血糖穩(wěn)定在16.9mmol/L以上作為糖尿病組，此時開場計算糖尿病鼠病程。1.4樣本制備于病程4、8、12周分別處死大鼠，對照組各3只及糖尿病組各7只，10%水合氯醛麻醉，5ml/kg,放血處死，取其雙眼，快速在顯微鏡下冰上分離視網(wǎng)膜組織，EP管凍存于-80℃，2只眼分開保存。1.5免疫組化染色使用免疫組化三步法：石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育5~10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡2次，每次5min.5%~10%正常山羊血清〔PBS稀釋〕封閉，室溫孵育10min,傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1~2h或4℃過夜。PBS沖洗3次，每次3min.滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30min.PBS沖洗3次，每次5min.滴加適量的辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30min.PBS沖洗，3次每次5min.DBA稀釋50倍顯色10min,自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，ImageProPlus6.0軟件分析圖像，以上切片每組隨機抽取10張切片進(jìn)行光密度分析，記錄每張片子的光密度〔opticaldensity,OD〕值。1.6檢測AT2R受體mRNA表示出由基因庫查得大鼠AT2R的mRNA核苷酸序列，取視網(wǎng)膜組織100mg,加液氮研碎后，用TRIzol提取總RNA.實驗組和對照組分別取1g總RNA以MMLV為逆轉(zhuǎn)錄酶作逆轉(zhuǎn)錄反響。cDNA產(chǎn)物保存于-20℃。優(yōu)化擴增條件，使PCR擴增在對數(shù)期內(nèi)進(jìn)行。在DNA擴增儀上進(jìn)行AT2R的PCR擴增30個循環(huán)。AT2R的退火溫度為62℃。取PCR擴增產(chǎn)物5l在1.5%瓊脂糖中電泳，ImagemasterVDS成像系統(tǒng)攝影存盤后應(yīng)用計算機圖像分析軟件〔TotallabV1.01〕行灰度掃描分析。以目的基因與-actin的PCR產(chǎn)物條帶灰度體積之比作為反映目的基因mRNA水平的相對指標(biāo)。1.7ERK信號通路檢測配10%的Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺膠，膠放入電泳槽，槽中加滿Tris-甘氨酸，樣品孔中加樣，電壓積層膠8V/cm〔40~60V〕，分離膠18V/cm〔100V〕，當(dāng)溴酚藍(lán)到底部停止，取出膠板，把分離膠放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min,裁取適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜，放入轉(zhuǎn)移緩沖液平衡10min.轉(zhuǎn)膜，電壓110V,1.5h;放入5%脫脂奶粉的TBS封閉液中平衡2.5h;滴加一抗，在室溫下翻轉(zhuǎn)搖床上作用2h,4℃過夜；TBST漂洗3次，每次15min,滴加二抗，室溫下翻轉(zhuǎn)搖床上作用1h;TBST漂洗3次，每次15min;ECL熒光顯影液反響、曝光、顯影和定影。-action為內(nèi)參照，計算待測蛋白條帶積分吸光度〔integratedabsorbance,IA〕與-action的比值，表示待測蛋白的相對表示出水平。1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x珋s表示；兩組數(shù)據(jù)比擬用t檢驗，相關(guān)指標(biāo)采用多元線性回歸分析。2結(jié)果2.1兩組大鼠的血糖水平及比擬結(jié)果顯示，糖尿病組的大鼠的血糖水平自第4周開場明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔P0.01〕。見表1.2.1糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及新生血管的情況通過凋亡染色，高倍視野下進(jìn)行光密度分析，結(jié)果顯示與對照組相比，4周、8周及12周病程的糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織中8-OHdG的表示出隨著病程延長增加[〔0.18270.025〕vs〔0.19870.021〕vs〔0.24250.314〕vs〔0.25200.028〕],各組CD14染色未見明顯新生血管的出現(xiàn)，各組CD14染色差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1.2.2RAS系統(tǒng)關(guān)鍵分子PRR和AT2R表示出水平4周、8周和12周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中PRR及AT2R含量明顯比正常大鼠高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔P0.05〕；進(jìn)一步進(jìn)行組間比擬，結(jié)果顯示，12周病程大鼠PRR及AT2RmRNA水平比8周病程大鼠顯著升高，8周病程大鼠PRR及AT2RmRNA水平較4周病程大鼠有明顯升高且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔P0.05〕。見圖2.2.3PRR及AT2R與視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系進(jìn)一步分析AT2R與PRR的表示出水平與8-OHdG水平能否存在一定的關(guān)系。通太多元線性回歸分析顯示，隨著病程時間的延長AT2R及PRR的表示出水平與細(xì)胞凋亡水平均呈正相關(guān)性〔P0.05〕。見表2.2.4Westernblot分析結(jié)果糖尿病組p-ERK1/2的表示出水平明顯比對照組高，并且隨病程的延長糖尿病組p-ERK1/2的表示出水平、磷酸化水平升高。見圖3.3討論糖尿病是一種由多種原因引起糖代謝紊亂的終身性內(nèi)分泌疾病，當(dāng)前世界范圍內(nèi)糖尿病患者人數(shù)約2.4億，估計到2025年將到達(dá)3.5億[4].隨著糖尿病護(hù)理水平的提高，糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展和流行有所下降[5].有統(tǒng)計學(xué)研究[6]顯示糖尿病病程和血壓是影響糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的重要因素。早期研究[7]顯示糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿中腎素原會在發(fā)展為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變時明顯增高，血漿腎素原水平可能是糖尿病微血管并發(fā)癥的敏感指標(biāo)。Wagneretal[8]用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反響技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)腎素mRNA陽性表示出的組織中，血管緊張素原及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶兩種基因也呈陽性表示出，進(jìn)一步從基因水平證實眼組織有獨立合成RAS的能力。糖尿病時，視網(wǎng)膜RAS活性加強，血管緊張素Ⅱ介入內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂，使得血管內(nèi)皮細(xì)胞上構(gòu)成單細(xì)胞層，同時促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的結(jié)合反響，并增加局部分泌細(xì)胞因子如組織壞死因子等，這些均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂、血管痙攣、血栓構(gòu)成、視網(wǎng)膜組織缺血低氧、新生血管構(gòu)成、出現(xiàn)增殖性病變。抑制RAS系統(tǒng)能夠控制糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[9-10].研究[11]顯示，糖尿病黃斑水腫患者伴有或不伴有玻璃體后脫離者玻璃體液中血管緊張素Ⅱ濃度比非糖尿病患者及不伴有視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者明顯升高，提示RAS系統(tǒng)在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。Parketal[12]指出氧化應(yīng)激加強會導(dǎo)致糖尿病血管病變，8-OHdG的水平標(biāo)志了體內(nèi)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷。Panetal[13]以血清8-OHdG為評價氧化應(yīng)激的指標(biāo)探測糖尿病視網(wǎng)膜病變的氧化應(yīng)激指標(biāo)，得出糖尿病視網(wǎng)膜病變組比正常組顯著增高。血清氧化應(yīng)激產(chǎn)物8-OHdG增加將預(yù)測糖尿病性視網(wǎng)膜病變的結(jié)論。本實驗利用免疫組化法檢測不同病程階段大鼠視網(wǎng)膜的凋亡因子8-OHdG,發(fā)現(xiàn)隨著病程的發(fā)展，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞8-OHdG表示出逐步增加，且明顯高于對照組，繼而能夠得出隨著病程的發(fā)展，糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡數(shù)量越多。RAS的生理作用主要通過血管緊張素Ⅱ與其受體〔AT1R和AT2R〕的結(jié)合來實現(xiàn)，利用RT-PCR法檢測糖尿病大鼠視網(wǎng)膜PRR及AT2RmRNA的表示出，了解不同病程糖尿病大鼠和正常大鼠RAS系統(tǒng)的表示出水平以及變化趨勢。結(jié)果顯示4周、8周和12周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中PRR及AT2R含量明顯比正常大鼠高。講明在發(fā)病后糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中RAS系統(tǒng)被明顯激活，并且隨著病程的發(fā)展RAS系統(tǒng)作用加強。PRR及AT2R的表示出也隨著病程的發(fā)展逐步增加，通過統(tǒng)計學(xué)分析顯示8-OHdG的表示出與PRR及AT2R的表示出有一定相關(guān)性，由此能夠得出在糖尿病視網(wǎng)膜病變中RAS系統(tǒng)與細(xì)胞凋亡有相關(guān)性，同時也進(jìn)一步證實了RAS與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展相關(guān)。利用Westernblot法檢測不同病程糖尿病大鼠和正常大鼠視網(wǎng)膜中ERK1/2和p-ERK1/2的表示出，了解到ERK信號通路在糖尿病視網(wǎng)膜病變中被激活，并且在隨著病情的發(fā)展ERK信號通路活性加強。提示糖尿病視網(wǎng)膜病變RAS系統(tǒng)的激活與ERK信號通路有關(guān)。由于CD14能夠標(biāo)記新生血管的產(chǎn)生，本實驗中通過免疫組化法檢測各病程中CD14的表示出，各階段病程中對照組及實驗組未見明顯CD14分子表示出，顯示無明顯新生血管生成。糖尿病視網(wǎng)膜病變實驗病程中均未發(fā)現(xiàn)新生血管，可能與實驗設(shè)計有關(guān)，本實驗大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變病程較局限，并未包含糖尿病視網(wǎng)膜病變的全部病程。本研究顯示糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展與RAS系統(tǒng)的激活有一定相關(guān)性，而RAS系統(tǒng)對組織的作用可能與ERK信號通路的激活相關(guān)，RAS系統(tǒng)對新生血管生成的作用還有待進(jìn)一步研究。以下為參考文獻(xiàn)[1]陳晨，王育璠，彭永德。腎素-血管緊張素阻斷劑對糖尿病視網(wǎng)膜病變的影響[J].世界臨床藥物，2020,33〔8〕：449-59.[2]KidaT,IkedaT,NishimuraM,etal.Renin-angiotensinsysteminproliferativediabeticretinopathyanditsgeneexpressionincul-turedhumanmllercells[J].JpnJOphthalmol,2003,47〔1〕：36-41.[3]高玉，吳晉暉，柳林。鏈脲佐菌素誘發(fā)性糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜病變模型的建立