實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的革蘭氏染色和形態(tài)觀察球菌桿菌弧菌實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的革蘭氏染色和形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握無菌操作技術(shù)和細(xì)菌抹片的制備方法2、學(xué)習(xí)掌握單染色的操作技術(shù)3、了解革蘭氏染色機(jī)理，并掌握其操作技術(shù)4、熟悉顯微鏡的使用、學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法二、實(shí)驗(yàn)原理---簡(jiǎn)單染色細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須對(duì)它們進(jìn)行染色。利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。此法操作簡(jiǎn)便，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。

常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，這是因?yàn)樵谥行浴A性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，在顯微鏡下更易于識(shí)別。常用作簡(jiǎn)單染色的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，此時(shí)可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。二、實(shí)驗(yàn)原理---簡(jiǎn)單染色染色前必須固定細(xì)菌。其目的有二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對(duì)染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時(shí)盡量維持細(xì)胞原有的形。二、實(shí)驗(yàn)原理---革蘭氏染色革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家ChristainGram氏創(chuàng)立的，革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法所以能將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。二、實(shí)驗(yàn)原理---革蘭氏染色革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脫色，最后用復(fù)染劑(如番紅)復(fù)染。經(jīng)此方法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰性菌。二、實(shí)驗(yàn)原理---革蘭氏染色當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，像簡(jiǎn)單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。。三、實(shí)驗(yàn)器材

1、菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌斜面菌種。2、顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、酒精燈、接種環(huán)、吸水紙、蓋玻片、試管、水浴鍋。3、草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇、0.5%番紅色液、蒸餾水、雙層瓶（香柏油和二甲苯）。四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色1、涂片：用1%鹽酸清潔玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸餾水，再用無菌操作的方法挑菌少許于玻片的水中，并充分混勻涂成薄膜。2、干燥：將涂片置火焰高處微熱烘干或自然干燥。3、固定：涂面朝上，通過微火2-3次。4、染色：待玻片泠卻后加結(jié)晶紫1-2滴于涂片上，覆蓋涂面染色1-2分鐘。5、水洗：傾去染色液，用水自玻片一端輕輕沖洗至流下的水變無色為止（注：勿沖去菌體）。6、干燥：自然干燥，或用吸水紙吸干。7、鏡檢：油鏡觀察并繪圖。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、菌落形態(tài)觀察：2、細(xì)菌簡(jiǎn)單染色：3、細(xì)菌革蘭氏染色。注意：菌落顏色、濕度、形狀、大小、透明度、顏色、邊緣是否規(guī)則等特征。染色過程：涂片→干燥→固定→染色（1min）→水洗→干燥→鏡檢注意事項(xiàng)：涂片：取菌量不能太大干燥：自然干燥水洗：水流不能直接沖在涂菌處滴加少量水挑取菌體涂片干燥固定染色水洗干燥2.革蘭氏染色1）、涂片：取清潔玻片一塊，在玻片兩端1/4處下面用記號(hào)筆分別標(biāo)明S和E（見圖示），并滴一滴蒸餾水，分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌涂布在相應(yīng)的區(qū)域內(nèi)。2.革蘭氏染色2、干燥與固定：方法同（一）中2，3步驟3、染色：

結(jié)晶紫染色1-2分鐘--水洗--碘液媒染1-2分鐘--水洗--酒精脫色15-20秒--水洗--番紅復(fù)染色2-3分鐘--水洗--干燥--鏡檢記錄。染色結(jié)果金黃色葡萄球菌革蘭氏染色結(jié)果染色結(jié)果大腸桿菌革蘭氏染色結(jié)果染色結(jié)果金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合菌樣的革蘭氏染色結(jié)果四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪圖記錄觀察結(jié)果顯微鏡放大倍數(shù)＝物鏡放大倍數(shù)×目鏡放大倍數(shù)

思考題1、在制作涂片中，為什么要進(jìn)行固定這一步？2、革蘭氏染色中哪一步關(guān)鍵，為什么？附：油鏡的使用雙目顯微鏡單目顯微鏡2.油鏡的原理油鏡的透鏡很小，從載玻片透過的光線通過空氣時(shí)，因介質(zhì)折光率不同，光線將發(fā)生散射現(xiàn)象，使射入鏡筒的光線很少，物象不清。若在油鏡與玻璃片之間加入與玻璃折射率相近的香柏油，則使通過的光線不至因折射而減弱，因此能清楚地看到物象。雙層瓶香柏油二甲苯實(shí)驗(yàn)報(bào)告注意事項(xiàng)1.上課前必須寫好預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)報(bào)