酶的分離純化

離心技術

層析技術第四章層析技術引言層析法的基本原理層析法的分類引言層析法的發(fā)現與進化歷史

思想層析法的基本原理根據引言內容,是否可以總結概括出層析法的基本原理？層析法的分類第一節(jié)吸附層析技術第二節(jié)分配層析技術第三節(jié)凝膠過濾層析技術第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）引言1850年德國科學家朗格首先發(fā)現了色譜分離的現象，當他把一種有顏色的物質滴到一張濾紙上，觀察到它們擴散成一圈圈的圓環(huán)。探索與發(fā)現11906年俄國植物學家茨維特（MichaelTswett）:將碳酸鈣細粉裝入玻璃瓶，石油醚抽提葉子的色素溶液傾入，接著倒入石油醚洗滌，柱上部出現了綠色的葉綠素，中間是黃色的葉黃素，而在下面則是胡蘿卜素橙黃色色帶叫作“色譜”，方法叫色譜法（Chromatography),層析法。探索與發(fā)現2概念:固定相,流動相,色譜柱現代色譜柱圖有誤Whichiswhich?1905-1930.Whocares!Why？1931年德國庫恩(Kuhn)重復了茨維特實驗,用氧化鋁和碳酸鈣分離了α-,β-,和γ-胡蘿卜素，此后用這種方法分離了60多種這類色素，1938年他從維生素

B

中分離出

B

6.1938年的諾貝爾化學獎。探索與發(fā)現3WhynotTswett?論文發(fā)表在不知名的期刊上相同時期發(fā)生在中國大地的事件1894年：中日甲午戰(zhàn)爭,侵占臺灣。1897年：德國侵占膠州灣。1900年：八國聯軍侵略中國。1914年：占領青島,奪取膠州灣。1931年：九一八事變,占領東北,建立滿州國。1937年：盧溝橋事變。1941年生物化學家Martin（馬?。┖蚐ynge（辛格）把色譜法應用于氨基酸的分離。將淀粉作為色柱里的填料:淀粉色譜法濾紙作為載體:紙色譜法覆蓋了吸附劑表面的并與流動相不發(fā)生混溶的固定液來代替以前的固體吸附劑:Liquid-liquid(partition)Chromatography,LLC).提出色譜塔板理論;預測氣相色譜;提出用細小顆粒作填料,而兩端可以加壓(HPLC).1952年：馬丁，辛格對分配層析的研究和發(fā)現，諾貝爾化學獎羊毛中的氨基酸分離探索與發(fā)現4塔板理論將色譜柱看作一個分餾塔，待分離組分在分餾塔的塔板間移動，在每一個塔板內不同組分分子在固定相和流動相之間形成平衡，隨著流動相的流動，組分分子不斷從一個塔板移動到下一個塔板，并不斷形成新的平衡分配系數,partitioncoefficient:在平衡狀態(tài)下，組分在固定相中的濃度和在流動相中的濃度之比.例:將MgCl2溶解于辛醇和水的混合液體,分別測量MgCl2在辛醇和水中的濃度,計算比值.好溶解的分配系數小,不好溶解的分配系數大.1952年，馬丁同詹姆斯(James)，把LLC技術原理應用在分離氣體上。各種氣體或蒸汽的混合物利用氮或氦一類情性載氣的氣流通過吸收性固體的表面?；旌系臍怏w通過后,在另一端出現時就分開了。氣相色譜的產生(GC)探索與發(fā)現5高效液相色譜(HPLC)的應用20世紀60年代以來,氣相色譜作為分析方法已經不能滿足對生物成分分析測試的要求。高效液相色譜采用了壓力泵及填有很細的顆粒高效色譜柱。HighPerformanceLiquidChromatography.探索與發(fā)現6液相色譜與氣相色譜法比較

氣相液相對象氣體,沸點低液相,沸點高固定相固體,固體涂層液固體,固液流動相惰性氣體,起運載作用液體，與組分可產生親和力環(huán)境高溫常溫應用化工分析，環(huán)境生物分子，蛋白核酸，醫(yī)藥層析法的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理、化學性質（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數等）的差異使各組分在兩相（固定相和流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。

物理、化學性質（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數等）

（1）按流動相狀態(tài)分類：液相色譜液-固層析液-液層析氣相色譜氣-固層析氣-液層析層析法的分類兩種固定相：(固定相不一定是固體)*固體吸附劑作為固定相*吸附在固體上的液體（硅膠吸附的水作固定相，以氯仿作流動相，分離羊毛中的氨基酸）（2）按層析原理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能

的差異，達到分離鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數（或溶解度）不同。離子交換層析:利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。（3）按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，類似紙層析。層析技術第一節(jié)

吸附層析技術第二節(jié)分配層析技術第三節(jié)凝膠過濾層析技術第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）√√√第一節(jié)吸附層析技術吸附柱層析薄層層析聚酰胺薄膜層析疏水層析√√吸附柱層析

吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱狀的一種層析方法。常用的吸附劑有羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁、人造沸石和活性炭等。這種層析方法已成為科研、醫(yī)學、化工及發(fā)酵等部門常規(guī)使用的一種分離手段。吸附柱層析一、常用術語1.層析：以基質為固定相（柱狀或薄層狀），以液體或氣體為流動相，有效成分和雜質在這兩個相中連續(xù)多次地進行分配、吸附、交換作用，最終結果是使混合物得到分離。吸附柱層析一、常用術語2.洗脫體積（Ve）：是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現濃度達到最大值時的流動相體積。第一節(jié)吸附層析技術吸附柱層析吸附薄層層析聚酰胺薄膜層析疏水層析√薄層層析(TLC)

薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。薄層層析可根據固定相的種類分為吸附薄層層析（吸附劑為固定相）、分配薄層層析（固定在支持劑上的水溶液或有機溶劑為固定相）和離子交換薄層層析（離子交換劑為固定相）等。薄層層析薄層層析的優(yōu)點：1.展層時間短，薄層層析分離混合物一般僅需15-60min；2.設備簡單，操作方便，既適用于分析，也適用于制備；3.靈敏度高。薄層層析紙色譜法（分配TLC，纖維結構，固定相是纖維-水）吸附TLC固定相是硅膠，氧化鋁等，層析是依據吸附力不同第三章層析技術第一節(jié)吸附層析技術第二節(jié)分配層析技術第三節(jié)凝膠過濾層析技術第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)第二節(jié)分配層析技術分配層析法（液-液層析法，LLC）原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的分配系數的不同而達到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動相流過固定相。分配系數：當一種溶質分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在流動相和固定相兩相內的濃度之比是個常數，稱為分配系數。K=c1/c2分配系數小的溶質在流動相中的分配的數量多，移動慢；分配系數大的溶質在固定相分配的數量多，移動快。因此可彼此分開。hH（分配TLC，纖維結構，固定相是纖維-水）紙色譜法第四章層析技術第一節(jié)吸附層析技術第二節(jié)分配層析技術第三節(jié)凝膠過濾層析技術第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)第三節(jié)凝膠過濾層析技術一、基本原理

概念：當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，因分子大小不同而分離。又名分子篩層析。原理：凝膠顆粒為多孔網狀結構?；旌衔锪鬟^時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在柱內經過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。吸收洗脫體積ml凝膠固定相與流動相：凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，流動相是流動的洗脫液。排阻極限：指不能進入凝膠顆?？籽▋炔康淖钚》肿拥姆肿恿?。排阻極限為30000表示30000Da的分子將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。3.凝膠顆粒大小

常以目數(mesh)或者顆粒直徑(mm)來表示。分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關。顆粒大，流速快，但分離效果差；顆粒小，分離效果較好，但流速慢。100目~0.250毫米。二、常用概念三、凝膠的種類和性質

1.交聯葡聚糖凝膠（Sephadex)

1)SephadexG(SephadexG-25；SephadexG-50)G后的數字為凝膠吸水率（單位是ml/g干膠）的10倍。2）SephadexLH-20，是SephadexG-25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質。

交聯葡聚糖凝膠是由葡聚糖和甘油基通過醚橋交聯而成的。

2.瓊脂糖凝膠（Sepharose；Bio-Gel)依靠糖鏈之間的次級鍵維持網狀結構，瓊脂糖密度越大，網狀結構越密集。3.Superdex是由高交聯度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結合而成的。分辨率非常高，化學物理穩(wěn)定性也很好。

4.聚丙烯酰胺凝膠一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯而成。交聯劑越多，孔隙度越小。商品名為生物膠-P（Bio-GelP)。凝膠技術參數指標凝膠型號：如SephadexG-10;G-25;粒度范圍：100-200mesh床體積（ml/g）:每克干膠溶漲后的體積有效分離范圍：如1x1031x107工作pH:4-12最大流速：1ml/min最大承受壓力:2MPa三、凝膠的選擇和保存

1.凝膠的選擇

例如樣品中各個組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達到分離的目的；如果有個別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。2.凝膠的保存

凝膠的保存一般是反復洗滌去除蛋白等雜質，然后加入適當的抗菌劑，通常加入0.02％的疊氮化鈉,或20%酒精,4C下保存。

四、

凝膠過濾在試驗室中的應用1）生物大分子物質的分離純化2）分子量的測定3）脫鹽及去除小分子雜質4）溶液濃縮5）去熱源物質LogMABCLogM測Ve蛋白質通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關，LogM=（k1-k2）Ve

（Ve為洗脫體積）先測得幾種標準蛋白質的Ve，并以其分子量對數對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。第四章層析技術第一節(jié)吸附層析技術第二節(jié)分配層析技術第三節(jié)凝膠過濾層析技術第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)一、原理:是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質、電荷基團和平衡離子。

第四節(jié)離子交換層析法纖維素—O—CH2—

COO-—Na+圖纖維素陽離子交換劑組成示意圖離子交換層析的基本原理示意圖++++———++++++++++—+++二、離子交換基質的分類及常見種類：（一）分類陽離子交換劑：磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、

羧酸（-COOH）、酚羥基（-OH）等

陰離子交換劑：伯胺（-NH2OH）、仲胺（-NHCH3OH）、

叔胺（-N（CH3）2OH）、季胺（-N（CH3）3OH）等

（二）種類1）樹脂型離子交換劑2）纖維素離子交換劑3）交聯葡聚糖離子交換劑4）瓊脂糖離子交換劑三、離子交換劑的再生與保存

離子交換劑可在柱上再生也可室內瓶裝保存。如離子交換纖維素可用2mol/LNaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％洗必泰，陽離子交換劑可用0.02％疊氮鈉。四、離子交換層析的實驗室應用除去離子（純凈水）聚苯乙烯樹脂廣泛的應用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面

分離純化改變成分（青霉素-Na＋——青霉素-K＋）濃縮與提?。股?、蛋白質、工業(yè)廢液中微量金屬的提取）離子型化合物分離發(fā)展：自動化方向與光譜技術結合－專門用途的綜合性自動分析儀與計算機相連－進行自動分析與自動控制第四章層析技術第一節(jié)吸附層析技術第二節(jié)分配層析技術第三節(jié)凝膠過濾層析技術第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）原理：

利用生物大分子間特異的親和能力來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體等。親和層析包括三個共價結合的組分：不溶性的基質（matrix）、一個間隔臂（spacer）及特異的配基（ligands）第五節(jié)親和層析法目前親和層析技術主要運用在實驗室中

FractionandmonitoringVolumeofeluentAbsorbanceFractions123456789Anactualexampleforgel-filtrationSDSanalysis第四章層析技術第一節(jié)吸附層析技術第二節(jié)分配層析技術第三節(jié)凝膠過濾層析技術第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）特點：①使用的固相支持劑顆粒很細，表面積很大,因而分辨率很高.（顆粒細，理論塔板數多）

②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。（顆粒硬度大、流速快，耐高壓）③重復性好④色譜柱可以反復使用⑤自動化操作，分析精確度高許多類型的柱層析都可用HPLC來代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。分類

正相色譜法：

共價結合到載體上的集團都是極性的集團，流動相的極性比固定相的極性弱。在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度，先從柱中流出來。

反相色譜法

共價結合到載體上的集團是一些直鏈碳氫化合物，流動相的極性比固定相的極性強。在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度而先從柱中流出?？炜煲话銇碚f，分離純化極性大的分子（帶電離子等）采用正相色譜（或正相柱），而分離純化極性小的有機分子（有機酸、醇、酚等）多采用反相色譜（或反相柱）。

實踐中，一種物質如蛋白的分離純化往往不是單一實驗技術能夠達到的。Whatdoesthismean？層析基本原理固相，流動相，色譜柱的概念洗脫體積，洗脫曲線的概念凝膠過濾層析高壓液相層析離子交換層析親和層析吸附層析分配層析(薄層層析)吸附柱層析一、常用術語1.固定相：是由層析基質組成的。其基質包括固體物質（如吸附劑、離子交換劑）和液體物質（如固定在纖維素或硅膠上的溶液），這些物質能與相關的化合物進行可逆的吸附、溶解和交換作用。2.流動相：在層析過程中推動固定相上的物質向一定方向移動的液體或氣體稱為流動相。在柱層析時，流動相又稱洗脫液或洗滌劑。在薄層層析時流動相又稱展層劑。吸附柱層析一、常用術語2.操作容量：即在特定條件下，某成分與基質反應達到平衡時，存在于基質上的飽和容量。一般以每克（或毫升）基質結合某種成分的毫摩爾數或毫克數來表示。其數值大，表明基質對某種成分的結合力強，否則反之。吸附柱層析二、基本原理吸附層析法（液-固層析法，LSC）原理：利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解度的差異進行分離。成分的極性決定于其分子中所含官能基團的極性和分子結構，物質的極性越大則越容易被固體吸附劑(硅膠或氧化鋁)吸附。特點：適合分離不同種類（例如分離醇和芳香烴）的化合物。三、吸附劑1.吸附劑的選擇及預處理：活性多孔固體，表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強和成本低廉等性能。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等。羥基羥基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2],可用于分離蛋白質、酶、核酸及病毒等生命物質。其表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團。羥基磷灰石層析在實驗室中最大的用途是分離雙鏈DNA和單鏈DNA。亦可除去混合物中的DNA。三、吸附劑硅膠(Silicagel)：略帶酸性，適用于酸性與中性樣品之分離，堿性樣品容易產生反應或拖尾。A.含水量活性硅膠是多孔的、表面含有很多硅醇基團（-Si-OH）顆粒狀極性吸附劑。含水量高時，則結合力?。ɑ蚧钚孕。.粒度

供層析用的氧化鋁，用于拄層析的，其粒度要求在100～160目之間。粒度大子100目，分離效果差：小于160目，溶濃流速大慢，易使譜帶擴散。樣品與氧化鋁的用量比，一般在1：20～50之間層析柱的內徑與柱長比例在1：10-20之向。三、吸附劑活性炭(Silicagel)：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80℃干燥后即可供層析用。層析用的活性炭，最好選用顆粒活注炭，若為活性炭細粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢?；钚蕴恐饕糜诜蛛x水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最強，在有機溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機溶劑則較強。例如以醇-水進行洗脫時，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉Ψ枷阕寤衔锏奈搅Υ笥谥咀寤衔?，對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質與脂肪族物質分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。吸附原理:吸附劑與被吸附物質之間的吸引力是范德華力，作用可逆吸附層析的應用氨基酸、肽、糖類、脂類、苷（皂苷）類物質的分離、鑒定純凈水、醫(yī)藥用水的制備藥液脫色薄層層析一、操作及注意事項：一般層析操作包括薄板制備、點樣、展層、顯色、Rf值測定和結果分析等步驟。1.薄層板的制備(1)硅膠的分類：硅膠G系含有10%~15%鍛石膏和5%淀粉的硅膠，黏性好；硅膠CMC系含有適量羧甲基纖維素的硅膠；硅膠HF254系含有熒光劑的硅膠H；薄層層析(Thinlayerchromatography)一、操作及注意事項：一般層析操作包括薄板制備、點樣、展層、顯色、Rf值測定和結果分析等步驟。1.薄層板的制備(2)硅膠薄層板的制備①玻板：洗凈；20cm20cm；6cm20cm②制板：涂布方法(玻棒涂布法、有機玻璃尺涂布法、半機械涂布法)；注意事項：顆粒均勻細小(>200目)；厚度均一適中(0.25mm-0.5mm-1mm)；2.點樣(<2mm)3.展層4.顯色聚酰胺薄膜層析1966年之后發(fā)展起來的一種層析方法；特別應該指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸時，具有靈敏度高、分辨力強、展層迅速和操作簡便等優(yōu)點?？捎糜诜宇?、醌類、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸堿基、核苷、核苷酸、雜環(huán)化合物、合成染料、磺胺、抗菌素、環(huán)酮、維生素B和殺蟲劑等16類化合物。GasChromatographyUsedtodeterminethechemicalcompositionofunknownsubstances,suchasthedifferentcompoundsingasolineshownbyeachseparatepeakinthegraphbelow.LiquidChromatographyUsedtoidentifyunknownplantpigments&othercompounds.ExamplesofChromatographyPaperChromatographyCanbeusedtoseparatethecomponentsofinks,dyes,plantcompounds(chlorophyll),make-up,andmanyothersubstancesThin-LayerChromatographyUsesthinplasticorglasstraystoidentifythecompositionofpigments,chemicals,andotherunknownsubstances.聚酰胺薄膜層析基本原理：聚酰胺對極性物質的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。由己二酸與己二胺聚合而成疏水層析(hydrophobicinteractionchromatography，HIC)疏水層析是根據分離成分和固定相之間疏水力差異性大小而得到分離。