實驗五質粒酶切質粒限制性內切酶消化酶切第一頁，共二十六頁，2022年，8月28日背景知識一、質粒圖譜的閱讀二、限制性內切酶第二頁，共二十六頁，2022年，8月28日

第一步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）

第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。

Ampr水解β－內酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

tetr可以阻止四環(huán)素進入細胞。

camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。

neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活

hygr

使潮霉素β失活。一、質粒圖譜的閱讀第三頁，共二十六頁，2022年，8月28日第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。第四步：再看外源DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。

一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉化效率越低。第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即：啟動子——核糖體結合位點——克隆位點——轉錄終止信號。

這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體的?？寺≥d體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。第四頁，共二十六頁，2022年，8月28日農桿菌復制起始位點大腸桿菌復制起始位點加尾信號，終止位點潮霉素抗性基因多克隆位點終止子加尾信號綠色熒光蛋白基因第五頁，共二十六頁，2022年，8月28日二、限制性內切酶1)概念2)命名原則3)類型4)基本特性及用途5)影響核酸限制性內切酶活性的因素6)Ⅱ限制性核酸內切酶操作的注意事項第六頁，共二十六頁，2022年，8月28日1)概念限制性核酸內切酶(restrictionednonuclease)是一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內或附近特異切割雙鏈DNA的內切核酸酶（endonuclease)的總稱。

至2006年2月共發(fā)現(xiàn)3773種限制性內切酶，I、II、III型各有68、3692、10種，甲基化指導的3種，商品化的609種，II型中共有223種特異性。第七頁，共二十六頁，2022年，8月28日2)命名原則1973年和D.Nathams首次提出命名原則，1980年Roberts在此基礎上進行了系統(tǒng)分類①限制性核酸內切酶第一個字母（大寫，斜體）代表該酶的宿主菌屬名(genus)；第二、三個字母(小寫，斜體)代表宿主菌種名(species)。②第四個字母代表宿主菌的株或型(strain)。③若從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內切酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。

屬名種名株系Haemophilusinfluenzae

d

流感嗜血桿菌d株

HindⅡ

HindⅢ同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶第八頁，共二十六頁，2022年，8月28日3)類型

據(jù)限制性核酸內切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三類。主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修飾蛋白結構輔助因子識別序列切割位點應用多功能異源三聚體ATP、Mg2+、SAM距識別序列1kb處隨機性切割不常用單功能同源三聚體Mg2+

4~6bp回文序列識別序列內或附近特異切割常用雙功能異源二聚體ATP、Mg2+距識別序列下游24~26bp處隨機性切割數(shù)量很少，無實際作用第九頁，共二十六頁，2022年，8月28日4)基本特性及用途

Ⅱ限制性核酸內切酶有嚴格的識別、切割順序，它以核酸內切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產生的DNA片段5′端為P，3′端為OH，識別序列一般為4～6個堿基對，通常是反轉錄重復順序，具有180°的旋轉對稱性即迴文結構。Ⅱ限制性核酸內切酶切割雙鏈DNA產生3種不同的切口。5′粘性末端3種切口3′粘性末端平頭末端第十頁，共二十六頁，2022年，8月28日第十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日第十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日第十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日Ⅱ限制性核酸內切酶的主要用途

①在特異位點上切割DNA，產生特異的限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶圖譜。③構建基因文庫。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。⑤改建質粒。第十四頁，共二十六頁，2022年，8月28日5)影響核酸限制性內切酶活性的因素

①DNA樣品純度②DNA樣品甲基化程度③酶的星活性(staractivity)第十五頁，共二十六頁，2022年，8月28日①DNA樣品純度

A）樣品雜有RNA

雖不影響酶反應速度，但RNA很易與酶蛋白發(fā)生非特異性結合而減少酶有效濃度，使酶解不徹底；另外，干擾DNA片段電泳觀察。

B）少量的蛋白質污染對酶解影響不大，但若有核酸酶等蛋白質污染時，會干擾酶切反應，并影響酶解產物。

C）樣品中雜有其他DNA

如質粒DNA中雜有染色體DNA，雖不影響酶解作用，但干擾酶解產物電泳圖譜并影響以后的重組連接反應。

D）其他雜質如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，會影響酶切速度，甚至改變酶的識別特異性，出現(xiàn)酶的第二活性。第十六頁，共二十六頁，2022年，8月28日②DNA樣品甲基化程度

限制性內切核酸酶的識別序列若被修飾酶產生了修飾反應，則該DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，DNA甲基化現(xiàn)象廣泛的存在于原核和真核生物中。如：AccⅠ識別序列能切割不能切割注意此處的區(qū)別dam甲基化酶識別序列AccⅠTCCGGAGAT×CCGG6mATC采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質粒DNA，可防止DNA的甲基化。第十七頁，共二十六頁，2022年，8月28日③酶的星活性(staractivity)

又稱第二活力，是指改變了酶切反應條件后特異序列識別特性降低的一種現(xiàn)象。由于識別特異性的降低，可能對原識別序列相似的序列也產生切割反應。高濃度甘油、高pH、低離子強度、巰基乙醇、DMSO、Mn2+等的存在可能導致酶產生星活性。第十八頁，共二十六頁，2022年，8月28日6)Ⅱ限制性核酸內切酶操作的注意事項

①商品化的限制性核酸內切酶均為濃縮液，每次操作時應使用新的吸頭去取酶；加入酶的體積應不超過總體積的10%，否則酶液中的甘油濃度超過5%時酶易產生星活性。②整個操作應在0℃進行，即在冰浴中進行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。③當切割大量DNA時，通常采用延長反應時間，減少酶的用量。④當DNA需2種或以上酶切時，應用通用緩沖液；若沒有通用緩沖液時，只有用1種酶切完后，純化酶切產物，再進行下一個酶切反應。第十九頁，共二十六頁，2022年，8月28日實驗目的１）了解酶切原理，掌握酶切體系建立原則２）用EcoRⅤ

切割質粒pCAMBIA13023）用EcoRⅤ切割銀杏基因組DNA第二十頁，共二十六頁，2022年，8月28日實驗原理限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。第二十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日

限制性內切酶EcoRⅤ特異性識別位點為：

GATATCCTATAGGATATCCTATAG產生平末端：第二十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日

則pCAMBIA1302經EcoRⅤ酶切后產生大小分別為：1600bp、2624bp和6325bp的三條DNA片段第二十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日

基因組DNA中由于有較多的EcoRⅤ識別位點，因此，經EcoRⅤ酶切后產生大小不一的條帶，電泳后整個泳道呈現(xiàn)均一的亮帶。