生化分離工程實驗指導(dǎo)老師：郝勃電子郵箱：haobo@聯(lián)系電話：辦公地點：菌株的優(yōu)化培養(yǎng)總DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR擴增目的基因乙醇沉淀回收線性化片斷大腸桿菌表達載體pET-28酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5挑取轉(zhuǎn)化子并抽提質(zhì)粒驗證表達質(zhì)粒(PCR及酶切驗證)檢索感興趣的基因（以katB為例）直接優(yōu)化并合成連T載測序結(jié)構(gòu)解析重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)挑取重組子,用菌落PCR方法驗證IPTG誘導(dǎo)促使目的大量蛋白表達細胞破碎及蛋白抽提目標蛋白的純化蛋白質(zhì)濃度測定--Bradford法目標蛋白的鑒定—Westernblotting結(jié)晶本次試驗內(nèi)容本次試驗的主要內(nèi)容His-Tag系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)katBfabZkatB是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的過氧化氫酶，其催化細胞內(nèi)過氧化氫分解，保護細胞組織，防止膜脂過氧化。在菌體中常以四聚體的形式存在。大腸桿菌fabZ基因編碼3-羥基脂酰ACP脫氫酶，是大腸桿菌脂肪酸代謝途徑中的必須基因，該基因的突變會導(dǎo)致細菌細胞的死亡。背景資料——目的基因fabZ

基因：474bp；蛋白17.8kDa，酶切后MBP標簽

42.5kDa

katB基因：1467bp；蛋白55.8kDa背景資料——表達載體pMAL-c2系列的載體帶有malE信號序列，能使融合蛋白穿過細胞膜。Imidazole（咪唑）

競爭關(guān)系背景資料——組氨酸和Ni-NTA親和作用原理系統(tǒng)原理示意圖pMALMBP標簽

42.5kDaSDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子表面活性劑。它能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，包裹蛋白，掩蓋電荷差異和形狀區(qū)別，使得電泳速率只與分子量有關(guān)。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N，N’—亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進行電泳。引發(fā)劑是過硫酸銨(APS)，催化劑是四甲基乙二胺（TEMED）。背景資料——聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)原理聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳，根據(jù)電荷差異和分子大小不同來分離蛋白質(zhì)。濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng)注意事項：有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。

丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用。因此必須小心操作，不得吸入和接觸皮膚，聚合完全聚丙烯酰胺凝膠無毒。凝膠配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡.水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡

※凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面.電泳前確保玻璃杯下面的氣泡去除干凈！生化分離工程實驗安排一、接種按2%的接種量將兩種菌株分別加入到含抗生素的LB培養(yǎng)基中,做好標記（寫清組號、基因信息、抗性）。二、誘導(dǎo)注：在加入IPTG之前，搖勻菌液并各取1ml于1.5ml的離心管中，做好標記（組號，基因名）記作“誘導(dǎo)前”，放于離心管板中，于-20℃保存。配試劑將超凈臺內(nèi)PA瓶中剩余的菌液用槍吸取200μl于1.5ml離心管中，10000rpm離心1min，棄上清(可用槍將上清吸盡)。加入200μl的無菌水洗滌菌體上殘留的培養(yǎng)基，10000rpm離心1min，棄上清，然后重懸于40μl滅過菌的去離子水中，100℃煮沸15min。

10000rpm離心1min，取上清5μl作為菌落PCR的模板。三、菌液PCR（驗證目的基因已轉(zhuǎn)入宿主菌中）PCR體系H2O8μl10XPCRbuffer2.5μldNTP2.0μl上游引物(F)1μl下游引物(R)

1μlTaq酶0.5μl模板5μl總體積20μlPCR程序95℃5min95℃35s55℃30s72℃40s/90s72℃10min25℃5minCycle30注：陽性對照(將模板換成1μl質(zhì)粒)；陰性對照（將模板換成5μl

H2O）；不用重復(fù)，PCR管上做好標記！瓊脂糖凝膠電泳1.制備0.8%瓊脂糖凝膠(已配好)。

2.膠板制備:將干凈的膠板放入膠槽中，并在固定位置放好梳子。再將配好的瓊脂糖凝膠在微波爐里充分融化，冷卻

到65℃左右后小心地倒入膠槽內(nèi)。室溫靜置直至凝

膠完全凝固，垂直輕拔梳子。將膠板放入電泳槽中，

添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板1-2㎜為止。3.加樣:將PCR后的樣品和與LoadingBuffer充分混勻后加入膠孔

中。每加完一個樣品，應(yīng)更換一個槍頭，以防污染。4.電泳:打開電源進行電泳（電壓80V）。約30min后，停止電泳。5.電泳完畢后，取出凝膠用溴化乙錠（EB）染色。6.觀察照相:在紫外燈下觀察并用拍照保存。將加入誘導(dǎo)劑后的菌液再放入37℃，200rpm的搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4-5h后收集菌體。注：在離心沉淀之前搖勻菌液取1ml于1.5ml的離心管中，做好標記（組號，基因名）記作“誘導(dǎo)后”放在第八組的離心管板上。離心時用天平嚴格配平（差異在0.02g之內(nèi))！四、收菌五、裂解細胞將冷凍保存的細胞團在室溫下解凍，冰上破碎至菌液成澄清（

200-300w超聲6×10s-10s，約20min）,天平嚴格配平后10000*g，4℃，離心20min。上清取1ml于1.5ml離心管中，作標記為“上清”沉淀用1ml對應(yīng)的buffer（his-tag為bindingbuffer，pMAL為columnbuffer）重懸后，保存在1.5ml的離心管中，標記為“沉淀”。六、蛋白純化注：收集到的蛋白做好標記后須在冰上保存，避免其失活pMAL?系統(tǒng)MBP標簽的切除從A595最大的幾管(一般是第二、第三管)取80μl用于蛋白酶FactorXa的酶解。在80μl洗脫液中取15μl保存在pcr管中，作為酶切對照。剩下的65μl加入3μl的FactorXa后混勻，室溫下反應(yīng)2h。分別在0.5h、1h、2h取樣15μl。注：每次取樣做好標記后，將樣品放于-20℃保存Ni柱的清洗與保存第1步：2倍體積6M鹽酸胍，0.2M醋酸第2步：2倍體積水第3步：1倍體積2%SDS（注意低溫容易析出）第4步：1倍體積25%乙醇第5步：1倍體積50%乙醇第6步：1倍體積75%乙醇第7步：5倍體積100%乙醇第8步：1倍體積75%乙醇第9步：1倍體積50%乙醇第10步：1倍體積25%乙醇第11步：1倍體積水第12步：5倍體積100mMEDTA，pH8.0第13步：3倍體積水由于EDTA處理后仍可有少量蛋白未能完全釋放，建議在純化不同蛋白時應(yīng)另換His·Bind樹脂。樹脂的再生當(dāng)柱流速明顯下降，或樹脂在使用離子化緩沖液處理之后沒能顯示深藍綠色，則樹脂需要更徹底的清洗處理。七、配制SDS注意：梳子厚度與膠板厚度要配套！

八、SDS電泳點樣順序：誘前、誘后、上清、沉淀、穿透液、W1、W終、Marker、E1、E2、E3、酶切后點樣：按1:1比例，取樣品加入loadingbuffer中，置沸水浴中煮沸10min，冷卻，離心1min，取上清液20ul點樣。(記錄點樣順序)點樣完畢后即可開始電泳，先以80v電壓跑15-20min，蛋白質(zhì)通過積層膠后，更換到120v，待溴酚藍接近分離膠底部后停止電泳，取下膠板，小心撬開膠板割取分離膠，放入染色皿中，加入一定染色液（沒過膠面即可）。置于搖床上染色3h左右。染色完畢后，回收染色液，加入脫色液，搖床脫色數(shù)次，最后一次可以過夜脫色。1、標準曲線的制作（1）標準蛋白質(zhì)溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成各濃度的標準蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮藍G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用蒸餾水稀釋至1L。九、蛋白濃度測定每加完一管立即在漩渦振蕩器上混合，2~5min后以1號為對照調(diào)零測A595以標準蛋白質(zhì)量（ug）為橫坐標，用吸光度A595為縱坐標作標曲。注：震蕩過程中不要太劇烈，以免產(chǎn)生較多氣泡而無法消除.管號1234567katB和Fabz(ul）