常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第20章本章內(nèi)容分子雜交與印跡技術(shù)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用基因文庫生物芯片技術(shù)生物大分子相互研究技術(shù)第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理復(fù)性RNADNA圖20-1核酸的分子雜交（一）印跡技術(shù)“blotting”，物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC)等各種膜上，成為固相化分子的技術(shù)。類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡用放射性核素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術(shù)二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡(SouthernBlotting)（二）RNA印跡(NorthernBlotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡(WesternBlotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。(四)其他斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)圖20-2三種印跡技術(shù)的比較圖20-3分子雜交實驗①②③圖20－4放射自顯影照片第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用PrincipleandApplicationofPolymeraseChainReaction一、PCR技術(shù)的工作原理5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA55555555Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。模板DNAdNTPs特異性引物耐熱DNA聚合酶Mg2+PCR體系基本組成成分變性95?C延伸72?C退火Tm-5?CPCR體系基本反應(yīng)步驟二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克?。ǘ┗蛲蛔儯ㄈ〥NA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析

RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)原位PCR(insituPCR)結(jié)合PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)，是將目的基因的擴增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（三）實時PCR技術(shù)實時PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。實時PCR分類：實時PCR非探針類SYBRGreen熒光染料

探針類1.TaqMan探針法2.

分子信標探針法3.FRET探針法圖20-5基于SYBRGreen染料法實時PCR技術(shù)圖20-6TaqMan探針法實時PCR原理示意圖第三節(jié)基因文庫GeneLibrary基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫：生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。載體:噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。二、cDNA文庫圖21-7基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選第四節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique也被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。將大量（通常每平方厘米點陣密度高于400)探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。一、基因芯片基因芯片(genechip)圖20-9基因芯片工作流程示意圖圖20-10

DNA芯片結(jié)果是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)（一）標簽蛋白沉淀應(yīng)用：證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位篩選細胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。圖21-11標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途圖21-12酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明生物信息學(xué)推測的蛋白質(zhì)相互作用。分析蛋白質(zhì)分子的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動測定電泳遷移率變動測定(EMSA)凝膠遷移變動實驗(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標記探針1X1X1X1X核蛋白提取物1X