第一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第八章微生物的遺傳變異與育種理想的工業(yè)發(fā)酵菌種應符合以下要求①遺傳性狀穩(wěn)定；②生長速度快，不易被噬菌體等異種微生物污染；③目標產物的產量盡可能接近理論轉化率；④目標產物最好能分泌到細胞外，以降低產物抑制并利于分離；⑤盡可能減少產物類似物的產量，以提高目標產物的產量并利于分離；⑥培養(yǎng)基成分簡單、來源廣、價格低廉；⑦對溫度、pH、離子強度、剪切力等環(huán)境因素不敏感；⑧對溶氧的要求低，便于培養(yǎng)及降低能耗。第二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日微生物的獨特生物學特性（1） 個體的體制極其簡單；（2） 營養(yǎng)體一般都是單倍體；（3） 易于在成分簡單的組合培養(yǎng)基上大量生長繁殖；（4） 繁殖速度快；（5） 易于積累不同的中間代謝產物或終產物；（6） 菌落形態(tài)特征的可見性和多樣性；（7） 環(huán)境條件對微生物群體中各個個體作用的直接性和均一性；（8） 易于形成營養(yǎng)缺陷型；（9） 各種微生物一般都有相應的病毒；（10） 存在多種處于進化過程中的原始有性生殖方式；第三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日微生物是研究現(xiàn)代遺傳學和其它許多主要的生物學基本理論問題中最熱衷的研究對象。對微生物遺傳規(guī)律的深入研究，不僅促進了現(xiàn)代分子生物學和生物工程學的發(fā)展，而且為育種工作提供了豐富的理論基礎，促使育種工作從不自覺到自覺、從低效到高效、從隨機到定向、從近緣雜交到遠緣雜交的方向發(fā)展。研究微生物遺傳學的意義第四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日遺傳與變異的概念遺傳和變異是生物體的最本質的屬性之一。遺傳(heredity)：親代生物的性狀在子代得到表現(xiàn)；親代生物傳遞給子代一套實現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息。特點：具穩(wěn)定性。遺傳型（genotype）：又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部基因的總和；------是一種內在可能性或潛力。

遺傳型+環(huán)境條件表型表型（phenotype）：指生物體所具有的一切外表特征和內在特性的總和;------是一種現(xiàn)實存在，是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。代謝發(fā)育第五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日變異(variation):生物體在外因或內因的作用下，遺傳物質的結構或數(shù)量發(fā)生改變。變異的特點：a.在群體中以極低的幾率出現(xiàn)，（一般為10-6～10-10）；b.形狀變化的幅度大；c.變化后形成的新性狀是穩(wěn)定的，可遺傳的。飾變（modification）：指不涉及遺傳物質結構改變而只發(fā)生在轉錄、轉譯水平上的表型變化。特點是：a.幾乎整個群體中的每一個個體都發(fā)生同樣的變化；b.性狀變化的幅度??；c.因遺傳物質不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消失后，表型即可恢復。例如：粘質沙雷氏菌：在25℃下培養(yǎng)，產生深紅色的靈桿菌素；在37℃下培養(yǎng)，不產生色素；如果重新將溫度降到25℃，又恢復產色素的能力。遺傳與變異的概念第六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第一節(jié)遺傳變異的物質基礎種質連續(xù)理論：1883~1889年間Weissmann提出。認為遺傳物質是一種具有特定分子結構的化合物?；驅W說：1933年摩爾根（ThomasHuntMorgan）發(fā)現(xiàn)了染色體，并證明基因在染色體上呈直線排列，提出了基因學說，使得遺傳物質基礎的范圍縮小到染色體上。但染色體是由核酸和蛋白質兩種長鏈高分子組成。20多種氨基酸經過不同排列組合，可以演變出的蛋白質數(shù)目幾乎可以達到一個天文數(shù)字，而核酸的組成卻簡單得多，一般僅由4種不同的核苷酸組成，它們通過排列核組合只能產生較少種類的核酸，因此當時認為決定生物遺傳型的染色體和基因，起活性成分是蛋白質。DNA是遺傳變異的物質基礎的證明：1944年以后，先后有利用微生物為實驗對象進行的三個著名實驗的論證（肺炎球菌的轉化試驗、噬菌體感染試驗、病毒的拆開與重建試驗），才使人們普遍接受核酸才是真正的遺傳物質。第七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日1928年，Griffith進行了以下幾組實驗：（1）動物實驗

對小鼠注射活RII菌或死SIII菌————小鼠存活

對小鼠注射活SIII菌————————小鼠死亡

對小鼠注射活RII菌和熱死SIII菌———小鼠死亡

抽取心血分離

活的SIII菌一、證明核酸是遺傳物質基礎的三個經典實驗研究對象：Streptococcuspneumoniae（肺炎雙球菌）

SIII型菌株：有莢膜，菌落表面光滑，有致病性

RII型菌株：無莢膜，菌落表面粗糙，無致病性（一）經典轉化實驗（transformation）第八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日混合培養(yǎng)RII型活菌SIII型活菌SIII型熱死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死Griffith轉化試驗示意

第九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（2）細菌培養(yǎng)實驗（3）S型菌的無細胞抽提液試驗以上實驗說明：加熱殺死的SIII型細菌細胞內可能存在一種轉化物質，它能通過某種方式進入RII型細胞并使RII型細胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉變?yōu)镾III型細胞。熱死SIII菌—————不生長

活RII菌—————長出RII菌

熱死SIII菌—————長出大量RII菌和10-6SIII菌活R菌+S菌無細胞抽提液——長出大量R菌和少量S菌+活RII菌平皿培養(yǎng)第十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質⑥加S菌的莢膜多糖活R菌長出S菌只有R菌

1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty從熱死S型S.pneumoniae中提純了可能作為轉化因子的各種成分，并在離體條件下進行了轉化試驗：只有S型細菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉化為S型。且DNA純度越高，轉化效率也越高。說明S型菌株轉移給R型菌株的，是遺傳因子。第十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（二）噬菌體感染實驗A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產生大量完整的子代噬菌體上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性第十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日沉淀中含25%放射性以32S標記蛋白質外殼做噬菌體感染實驗（2）含35S-蛋白質的一組：放射性75%在上清液中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產生大量完整的子代噬菌體上清液中含75%放射性第十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（三）植物病毒的重建實驗為了證明核酸是遺傳物質，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進行了著名的植物病毒重建實驗。將TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質外殼與RNA核心相分離。分離后的RNA在沒有蛋白質包裹的情況下，也能感染煙草并使其患典型癥狀，而且在病斑中還能分離出正常病毒粒子。第十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日MTV HRVHRV MTV（1）RNA（TMV）-蛋白質（HRV）（2）RNA（HRV）-蛋白質（TMV）用兩種雜合病毒感染寄主：（1）表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常TMV粒子（2）表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常HRV粒子。

上述結果說明，在RNA病毒中，遺傳的物質基礎也是核酸。選用TMV和霍氏車前花葉病毒（HRV），分別拆分取得各自的RNA和蛋白質，將兩種RNA分別與對方的蛋白質外殼重建形成兩種雜合病毒：第十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（一）核酸存在的七個水平及質粒細胞水平：存在于細胞核或核質體，單核或多核細胞核水平:原與真核生物的細胞核結構不同，核外DNA染色體水平:倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復制能力的遺傳功能單位，長度與信息量，轉錄——翻譯密碼子水平： 信息單位,起始和終止,核苷酸水平： 突變或交換單位，四種堿基二、遺傳物質在細胞內的存在部位和方式第十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日三、原核生物的質粒定義：是一類小型閉合環(huán)狀核外雙螺旋DNA分子，能獨立于細胞核進行自主復制。大?。杭s為2-100×106Dalton，上面攜帶有數(shù)個到數(shù)十個甚至上百個基因。性質：①可以在細胞質中獨立于染色體之外獨立存在（游離態(tài)），也可以通過交換摻入染色體上，以附加體（episome）的形式存在；②質粒是一種復制子（replicon），根據(jù)自我復制能力的不同，可把質粒復制的控制形式分為嚴緊型和松弛型兩種，嚴緊型質粒的復制受細胞核控制，與染色體DNA復制相伴隨,一般一個寄主細胞內只有少數(shù)幾個（1-5）個拷貝；松弛型質粒的復制不受細胞核控制，在染色體DNA復制停止的情況下仍可以進行復制，在細胞內的數(shù)量可以達到10-200個或更多。第十七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日③可以通過轉化、轉導或接合作用而由一個細菌細胞轉移到另一個菌細胞中，使兩個細胞都成為帶有質粒的細胞；質粒轉移時，它可以單獨轉移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進行轉移，所以它可成為基因工程的載體。④對于細菌的生存并不是必要的⑤功能多樣化功能：進行細胞間接合，并帶有一些基因，如產生毒素、抗藥性、固氮、產生酶類、降解功能等。重組：在質粒之間、質粒與染色體之間菌可發(fā)生。存在范圍：很多細菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcuslactis、根癌土壤桿菌等制備：包括增殖、裂解細胞、分離質粒與染色體和蛋白質等成分、去除RNA和蛋白質等步驟。鑒定：電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法三、原核生物的質粒第十八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日幾種代表性質粒Figure.RepresentativeFERTILITYPLASMID.Afertilityplasmidcarriesthegenesforconjugationaswellasanumberofothergenes.Inthisfigurethefertilityplasmidalsocarriesantibioticresistantgenes.1.F–因子（fertilityfactor）：又稱致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相當于核染色體DNA2%的環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關。存在于腸細菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細菌中，決定性別。第十九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日最初發(fā)現(xiàn)于痢疾志賀氏菌（Shigelladysenteriae），后來發(fā)現(xiàn)還存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相連的兩個DNA片段組成，即抗性轉移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性決定R因子（r-determinant），RTF為分子量約為11×106Dalton，控制質粒copy數(shù)及復制，抗性決定質粒大小不固定，從幾百萬到100×106Dalton以上。其上帶有其它抗生素的抗性基因。R-因子在細胞內的copy數(shù)可從1~2個到幾十個，分為嚴緊型和松弛型兩種，經氯霉素處理后，松弛型質?？蛇_2000~3000個/細胞。2.R因子（resistancefactor）第二十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日產大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的細菌素，能通過抑制復制、轉錄、轉譯或能量代謝等而專一地殺死其它腸道細菌。其分子量約4×104-8×104Dalton。大腸桿菌素都是由Col因子編碼的。Col因子可分為兩類，分別以ColE1和ColIb為代表。ColE1分子量約為5×106Dalton，無接合作用，是多copy的；ColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組DNA的研究和用于體外復制系統(tǒng)上。ColIb分子量約為80×106Dalton，它與F因子相似，具有通過接合作用轉移的功能，屬于嚴緊型控制，只有1-2個copy。凡帶Col因子的菌株，由于質粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。3.Col因子（colicinogenicfactor）第二十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日4.Ti質粒（tumorinducingplasmid）即誘癌質粒。存在于根癌土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）中,可引起許多雙子葉植物的根癌。當細菌侵入植物細胞中后，在其細胞中溶解，把細菌的DNA釋放到植物細胞中。這時，含有復制基因的Ti質粒的小片段與植物細胞中的核染色體發(fā)生整合，破壞控制細胞分裂的激素調節(jié)系統(tǒng)，從而使它轉變成癌細胞。Ti質粒長200kb，是一個大型質粒。當前，Ti質粒已成為植物遺傳工程研究中的重要載體。一些具有重要性狀的外源基因可借DNA重組技術設法插入到Ti質粒中，并進一步使之整合到植物染色體上，以改變該植物的遺傳性，達到培育植物優(yōu)良品種的目的。第二十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日是近年來在Rhizobium（根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質粒，分子量為200~300×106Dalton，比一般質粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質粒，其上有一系列固氮基因。6.巨大質粒（mega質粒）5.降解性質粒降解性質粒只在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質?？蔀橐幌盗心芙到鈴碗s物質的酶編碼，從而能利用一般細菌所難以分解的物質做碳源。這些質粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟腦）質粒，XYL（二甲苯）質粒，SAL（水楊酸）質粒，MDL（扁桃酸）質粒，，NAP（奈）質粒和TOL（甲苯）質粒等。第二十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日基因原核生物基因系統(tǒng)：

啟動子（基因） 操縱子 操縱子（基因）基因調控系統(tǒng)結構基因

調節(jié)基因基因是能夠表達和產生基因產物（蛋白質或RNA）的DNA序列。第二十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日細胞水平：大部分或全部DNA都集中于細胞核或核質體中，不同種類微

生物或同種不同細胞中細胞核的數(shù)目不同；

染色體水平：真核微生物的每個細胞核內含有一定數(shù)量的染色體；而原核微生物中一個核質體就是一個裸露的、光學顯微鏡下不能看到的環(huán)狀染色體。一些真核生物和原核生物基因組的比較

生物單倍體的分子量核苷酸已知染色體數(shù)約數(shù)（Da）對數(shù)基因數(shù)人 32 3~5×10125~7×109~4000黑腹果蠅4 7.9×10108.0×1075000~6000粗糙脈孢菌7 2.8×10104.5×107>500大腸桿菌1 2.5×1093.8×106 ~1027噬菌體T41 1.1×1082.0×105 ~135噬菌體1 3.2×107

4.8×104~35噬菌體MS21 1.1×1063.5×1033 第二十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日密碼子（coden）：由3個核苷酸順序決定，負載遺傳信息的基本單位不對稱轉錄：只有DNA雙鏈的一股才作為有意義鏈被轉錄，這種現(xiàn)象又稱不對稱轉錄。起始密碼子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸終止密碼子：UAA、UGA、UAG遺傳密碼指DNA鏈上各個核苷酸的特定排列順序第二十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日核外DNA的種類核外染色體真核生物的“質?！痹松锏馁|粒 線粒體細胞質基因 葉綠體（質體） 中心體 動體共生生物： 卡巴顆粒酵母菌的2m質粒F因子R因子Col質粒Ti質粒巨大質粒降解性質粒第二十七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第二節(jié)基因突變和誘變育種突變（mutation）指生物體的表型突然發(fā)生的可遺傳的變化。染色體畸變——細胞學上可以看到染色體的變化基因突變——細胞學上看不到遺傳物質的變化突變體（mutant）發(fā)生了突變的微生物細胞或菌株野生型（wildtype）從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株第二十八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日★依表型的改變分為：形態(tài)突變型——營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失產生某種生物合成酶的能力，并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質才能生長的突變類型。發(fā)酵突變型——喪失產生某種生物合成酶能力的突變型抗性突變型——因突變而產生了對某種化學藥物或致死物理因子的抗性條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型抗原突變型——因突變而引起的抗原結構發(fā)生改變產量突變型——

（一）基因突變的類型第二十九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日★按是否比較容易、迅速地分離到發(fā)生突變的細胞來分：選擇性突變株（selectivemutant）：具有選擇標記（如營養(yǎng)缺陷性、抗性突變型、條件致死突變型），只要選擇適當?shù)沫h(huán)境條件，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，就比較容易檢出和分離到。非選擇性突變株（non-selectivemutant）：無選擇標記（如產量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。第三十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第三十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（二）突變率定義：每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率為10–8是指該細胞在一億次細胞分裂中，會發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。如一個含108個細胞的群體，當其分裂為2×108個細胞時，即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10–8。突變率=突變細胞數(shù)/分裂前群體細胞數(shù)突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。在同一個細胞中同時發(fā)生兩個基因突變的幾率是極低的，因為雙重突變型的幾率只是各個突變幾率的乘積。由于突變的幾率一般都極低，因此，必須采用檢出選擇性突變株的手段，尤其是采用檢出營養(yǎng)缺陷型的恢復突變株（backmutant或reversemutant）或抗性突變株特別是抗藥性突變株的方法來加以確定。第三十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日若干細菌某一性狀的自發(fā)突變率菌名 突變性狀變率E.coli 抗T1噬菌體 3×10–8E.coli 抗T3噬菌體 1×10–7

E.coli 不發(fā)酵乳糖 1×10–10E.coli 抗紫外線 1×10–5Staphylococcusaureus 抗青霉素 1×10–7S.aureus 抗鏈霉素 1×10–9

Salmonellatyphi 抗25g/L鏈霉素 1×10–6

Bacillusmegaterium 抗異煙肼 5

×10–5

第三十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（三）突變的特點適用于整個生物界，以細菌的抗藥性為例。不對應性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應關系。自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響?？烧T發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳?？赡嫘裕簭脑嫉囊吧突虻阶儺愔甑耐蛔兎Q為正向突 變（forwardmutation），從突變株回到野生型的過程則稱為回復突變或回變（backmutation或reversemutation）。第三十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（四）基因突變的自發(fā)性和不對應性的證明在各種基因突變中，抗性突變最為常見。但在過去相當長時間內對這種抗性產生的原因爭論十分激烈。一種觀點認為，突變是通過適應而發(fā)生的，即各種抗性是由其環(huán)境（指其中所含的抵抗對象）誘發(fā)出來的，突變的原因和突變的性狀間是相對應的，并認為這就是“定向變異”，也有人稱它為“馴化”或“馴養(yǎng)”。另一種看法則認為，基因突變是自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對的。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯綜在一起，所以難以探究問題的實質。從1943年起，經過幾個嚴密而巧妙的實驗設計，主要攻克了檢出在接觸抗性因子前已產生的自發(fā)突變株的難題，終于解決了這場紛爭。第三十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日變量試驗又稱波動試驗或彷徨試驗。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計學原理，設計了左方的實驗。1.變量試驗fluctuationtest第三十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日2.涂布試驗原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率。第三十七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日涂布試驗中突變率的計算初始接種量：5×104個/皿培養(yǎng)5小時，繁殖了12.3代，每個微菌落約含5100個細菌這時，每個平皿上的細胞數(shù)為：5100×5×104≈2.6×108個/皿在6個平板上，比接種時增加的細胞數(shù)為： 6×（2.6×108

5×104）=15.6×108在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn)28個突變，故突變率=28/15.6×108=1.8×108第三十八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日3.平板影印培養(yǎng)試驗（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫婦的論文《平板影印培養(yǎng)法和細菌突變株的間接選擇》，更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產生的，這一突變與相應藥物環(huán)境毫不相干。平板影印培養(yǎng)法，是一種能達到在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上出現(xiàn)相同遺傳型菌落的接種培養(yǎng)方法：把長有許多菌落的母種培養(yǎng)皿倒置于包有滅菌絲絨布的木質圓柱印章上，使其沾上來自平板上的菌落。然后可把這一“印章”上的菌落一一接種到不同的選擇性培養(yǎng)基平板上。待這些平板培養(yǎng)后，對各平板相同位置上的菌落作對比后，就可選出適當?shù)耐蛔冃途?。?jù)報道，用此法可把母平板上10~20%量的細菌轉移到絲絨布上，并可利用這一“印章”接種8個子培養(yǎng)皿。因此，通過影印培養(yǎng)法，就可以從在非選擇性條件下生長的細菌群體中，分離出各種類型的突變。第三十九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第四十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日平板影印培養(yǎng)法在根本未接觸過任何一點鏈霉素的情況下，就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株，充分說明了突變是自發(fā)產生的，鏈霉素只是起到了一種檢出作用。平板影印培養(yǎng)不僅在微生物遺傳理論的研究中有重要應用，而且在育種時間和其它研究中均有應用，值得很好地領會。第四十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（五）基因突變的機制基因突變的原因是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的，誘變又可分為點突變和畸變。具體類型可歸納如下：第四十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日1.誘變機制誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑.種類：誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有幾種作用方式。按照遺傳物質結構變化的特點討論幾種有代表性的誘變劑的作用機制。第四十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（1）堿基置換（substitution）定義：對DNA來說，堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷（microlesion），一般也稱點突變（pointmutation）。它只涉及一對堿基被另一對堿基所置換。分類：轉換（transition），即DNA鏈中的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換；

顛換（transversion），即一個嘌呤被一個嘧啶,或是一個嘧啶被一個嘌呤所置換。對某一具體誘變劑來說，即可同時引起轉換與顛換，也可只具其中的一種功能。根據(jù)化學誘變劑是直接還是間接地引起置換，可把置換的機制分成以下兩類來討論。第四十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第四十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日直接引起置換的誘變劑定義：一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學反應的誘變劑，不論在機體內或是在離體條件下均有作用。種類：很多。例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。作用：它們可與一個或幾個核苷酸發(fā)生化學反應，從而引起DNA復制時堿基配對的轉換，并進一步使微生物發(fā)生變異。羥胺只引起G┇C→A:T，其余都是可使G┇C=A:T發(fā)生互變的。能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有（參見下表）。第四十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日若干誘變劑的作用機制及誘變功能誘變因素在DNA上的初級效應遺傳效應堿基類似物摻入作用AT=GC雙向轉換羥胺與胞嘧啶起反應GC→AT的轉換亞硝酸 A、G、C的氧化脫氨作用交聯(lián)AT=GC雙向轉換缺失烷化劑烷化堿基（主要是G）烷化磷酸基團喪失烷化的嘌呤糖-磷酸骨架的斷裂AT=GC雙向轉換AT→TA的顛換GC→CG的顛換巨大損傷（缺失、重復、倒位、易位）丫啶類堿基之間相互作用雙鏈變形碼組移動（＋或－）紫外線嘧啶的水合物形成嘧啶的二聚體交聯(lián)GC→AT轉換碼組移動（＋或－）電離輻射堿基的羥基化核降解DNA降解 糖-磷酸骨架的斷裂喪失嘌呤AT=GC雙向轉換碼組移動（＋或－）巨大損傷（缺失、重復、倒位、易位）加熱C脫氨基CG→TA轉換Mu噬菌體結合到一個基因中間碼組移動 第四十七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用

HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）HNO2腺嘌呤（A）次黃嘌呤（H）HNO2鳥嘌呤（G）黃嘌呤（X）這些反應及形成物均可在DNA復制中產生影響，主要是使堿基對發(fā)生轉換。堿基轉換的分子機制——以亞硝酸為例第四十八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第四十九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日

腺嘌呤（A）變成次黃嘌呤（H）后引起的轉換過程①腺嘌呤氧化脫氨后形成烯醇式次黃嘌呤（He）②He通過互變異構效應形成酮式次黃嘌呤（HK）③DNA復制時，HK與胞嘧啶（C）配對④DNA第二次復制時，C與G正常配對，實現(xiàn)轉換。第五十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日亞硝酸引起的AT-GC轉換細節(jié)第五十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日這類誘變劑主要是一些堿基類似物,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5—AU）、疊氮胸腺嘧啶（AIT）等等；

作用方式：通過活細胞的代謝活動參入到DNA分子中，主要是在DNA復制時堿基類似物插入DNA中，引起堿基對配對錯誤，造成堿基置換。以5-溴尿嘧啶(5-BU)為例：5-BU是胸腺嘧啶（T）的類似物，酮式的5-BU可以和A配對，烯醇式的5-BU可以和G配對，在DNA分子復制的過程中，由于5-BU的插入和互變異構導致堿基置換。間接引起置換的誘變劑第五十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第五十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日5-BU引起的轉換第五十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日5-BU引起的轉換從上圖中，還可以看到5-BU的摻入引起的G┇C回復到A?T的過程。通過這兩個圖示，就很容易理解為什么同一種誘變劑既可造成正向突變，又可使它產生回復突變的原因了。也可以知道，為什么像5-BU這類代謝類似物只有對正在進行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對休止細胞、游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。第五十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第五十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（2）移碼突變frame-shiftmutation或phase-shiftmutation，指誘變劑使DNA分子中增加（插入）或缺失一個或少數(shù)幾個核苷酸，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉錄和轉譯錯誤的一類突變。由移碼突變所產生的突變株，稱為移碼突變株（frame-shiftmutant）。與染色體畸變相比，移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷。丫啶類染料，包括原黃素、丫啶黃、丫啶橙和α-氨基丫啶等，以及一系列稱為ICR類的化合物，都是移碼突變的有效誘變劑。第五十七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日圖8-14——能誘發(fā)移碼突變的幾種代表性化合物引起移碼突變的誘變劑：主要是吖啶類染料，如吖啶黃、吖啶橙等等。這類化合物都是平面型的三環(huán)分子，它們的結構與一個嘌呤—嘧啶對十分相似。第五十八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日丫啶類化合物的誘變機制至今還不很清楚。有人認為，由于它們是一種平面型三環(huán)分子，結構與一個嘌呤–嘧啶對十分相似，故能嵌入兩個相鄰DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開（兩個堿基對原來相距0.34nm，當嵌入一個丫啶分子時，就變成0.68nm），從而在DNA復制過程中，會使鏈上增添或缺失一個堿基，結果就引起了移碼突變。第五十九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復突變圖示第六十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第六十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（3）染色體畸變（chromosomalaberration）某些理化因子，如X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起點突變外，還會引起DNA的大損傷（macrolesion）——染色體畸變，它包括：染色體結構上的變化：缺失（deletion）重復（duplication）易位（translocation）倒位（inversion）染色體數(shù)目的變化第六十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日染色體結構上的變化分為染色體內畸變和染色體間畸變兩類。染色體內畸變：只涉及一條染色體上的變化，如發(fā)生染色體的部分缺失或重復時，其結果可造成基因的減少或增加；如發(fā)生倒位或易位時，則可造成基因排列順序的改變，但數(shù)目卻不改變。倒位--------是指斷裂下來的一段染色體旋轉180后，重新插入到原來染色體的原位置上，從而使其基因順序與其它的基因順序相反；易位--------是指斷裂下來的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上。染色體間畸變：指非同源染色體間的易位。第六十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日染色體畸變第六十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日

轉座因子（transposibleelement）由40年代B.McClintock對的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位，自1967年以來，已在微生物和其它生物中得到普遍證實，并已成為分子遺傳學研究中的一個熱點。舊概念：基因是固定在染色體DNA上的一些不可移動的核苷酸片段。新發(fā)現(xiàn)：有些DNA片段不但可在染色體上移動，還可從一個染色體跳到另一個染色體，從一個質粒跳到另一個質?；蛉旧w，甚至還從一個細胞轉移到另一個細胞。在這些DNA順序的跳躍過程中，往往導致DNA鏈的斷裂或重接，從而產生重組交換或使某些基因啟動或關閉，結果導致突變的發(fā)生。轉座因子（transposibleelement）：在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA順序。也稱作跳躍基因（jumpinggene）或可移動基因（movablegene）。第六十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日轉座因子的種類（1）插入序列（IS，insertionsequence）：特點是分子量最?。▋H0.7~1.4kb），只能引起轉座（transposition）效應而不含其它基因?？梢栽谌旧w、F因子等質粒上發(fā)現(xiàn)它們。已知的IS有5種，即IS1、IS2、IS3、IS4和IS5。E.coli的F因子和核染色體組上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通過這些同源序列間的重組，就可使F因子插入到E.coli的核染色體組上，從而使后者成為Hfr菌株。因IS在染色體組上插入的位置和方向的不同，其引起的突變效應也不同。IS引起的突變可以回復，其原因可能是IS被切離，如果因切離部位有誤而帶走IS以外的一部分DNA序列，就會在插入部位造成缺失，從而發(fā)生新的突變。第六十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日轉座因子的種類（2）轉座子（Tn，transposon，又稱轉位子，易位子）：IS和Mu噬菌體相比，Tn的分子量是居中的（一般為2~25kb）。它含有幾個至十幾個基因，其中除了與轉座作用有關的基因外，還含有抗藥基因或乳糖發(fā)酵基因等其它基因。Tn雖能插到受體DNA分子的許多位點上，但這些位點似乎也不完全是隨機的，其中某些區(qū)域更易插入。第六十七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日轉座因子的種類（3）Mu噬菌體（即mutatorphage，誘變噬菌體）：它是E.coli的一種溫和噬菌體。與必須整合到宿主染色體特定位置上的一般溫和噬菌體不同，Mu噬菌體并沒有一定的整合位置。與以上的IS和Tn兩種轉座因子相比，Mu噬菌體的分子量最大（37kb），它含有20多個基因。Mu噬菌體引起的轉座可以引起插入突變，其中約有2%是營養(yǎng)缺陷型突變。第六十八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日2.自發(fā)突變機制自發(fā)突變是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變。幾種自發(fā)突變的可能機制微生物自身有害代謝產物的誘變效應過氧化氫是普遍存在于微生物體內的一種代謝產物。它對Neurospora（脈孢菌）有誘變作用，這種作用可因同時加入過氧化氫酶而降低，如果在加入該酶的同時又加入酶抑制劑KCN，則又可提高突變率。這就說明，過氧化氫很可能是“自發(fā)突變”中一種內源性誘變劑。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣的原因。第六十九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日互變異構效應堿基T、G的第六位上是酮基，會以酮式或烯醇式兩種互變異構的狀態(tài)出現(xiàn)C、A的第六位上是氨基，會以氨基式或亞氨基式兩種互變異構的狀態(tài)出現(xiàn)平衡一般趨向于酮式或氨基式，在DNA雙鏈結構中一般總是以A︰T和G┇C堿基配對的形式出現(xiàn)在偶然情況下，在DNA復制到達這一位置的瞬間，在T以稀有的烯醇式出現(xiàn)時，其相對位置上就出現(xiàn)G同樣，如果C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)在DNA復制到達這一位置的瞬間，則在新合成DNA單鏈中與C相對應的位置上就將是A。這可能就是發(fā)生相應的自發(fā)突變的原因。要預言在某一時間、某一基因發(fā)生自發(fā)突變是不可能的。在運用數(shù)學方法對這些偶然事件做大量統(tǒng)計分析后，可以發(fā)現(xiàn)并掌握其中的規(guī)律。例如，據(jù)統(tǒng)計，堿基對發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為10–8~10–9。第七十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日環(huán)出效應即環(huán)狀突出效應。有人提出，在DNA的復制過程中，如果其中某一單鏈上偶然產生一個小環(huán)，則會因其上的基因越過復制而發(fā)生遺傳缺失，從而造成自發(fā)突變。下圖就是環(huán)出效應的設想機制。在上鏈中，標記B處發(fā)生“環(huán)出”，故只有A及C能獲得復制，從而發(fā)生自發(fā)突變。而在下鏈中，復制仍正常進行第七十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日（六）紫外線對DNA的損傷及其修復已知的DNA損傷類型很多，機體對其修復的方式也各異。發(fā)現(xiàn)較早和研究得較深入的是紫外線（U.V.，ultravioletray）的作用。嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌呤強得多。嘧啶的光化產物主要是二聚體和水合物。其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消除。紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價結合的胸腺嘧啶二聚體。二聚體的出現(xiàn)會減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結構扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對，從而有可能引起突變或死亡。在互補雙鏈間形成嘧啶二聚體的機會較少。但一旦形成，就會妨礙雙鏈的解開，因而影響DNA的復制和轉錄，并使細胞死亡。第七十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第七十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日光復活作用（photoreactivation）定義：經紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復活作用。這一現(xiàn)象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomycesgriseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來，在許多微生物中都得到了證實。最明顯的是在E.coli的實驗中：對照：8×106個/mlE.coliU.V. 100個/mlE.coli試驗：8×106個/mlE.coliU.V.360~490nm2×106個/mlE.coli

可見光，30分經紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會被一種光激活酶（photoreactivatingenzyme）即光裂合酶（photolyase）結合，當形成的復合物暴露在可見光（300~500nm）下時，此酶會因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。與此同時，光激活酶也從復合物中釋放出來，以便重新執(zhí)行功能。每一E.coli細胞中約含有25個光激活酶分子。由于一般的微生物中都存在著光復活作用，所以進行紫外線誘變育種時，只能在紅光下照射及處理照射后的菌液。第七十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日圖:光復活作用第七十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日暗修復作用（darkrepair）又稱切除修復（excisionrepair）。是活細胞內一種用于修復被紫外線等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機制。這種修復作用與光無關。有四種酶參與——①內切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5’一側切開一個3’-OH和5’-P的單鏈缺口；②外切核酸酶從5’-P至3’-OH方向切除二聚體，并擴大缺口；③DNA聚合酶以DNA的另一條互補鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起逐個延長，重新合成一段缺失的DNA鏈；④通過連接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3’-OH末端與原鏈的5’-P末端相連接，從而完成了修復作用。第七十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日暗修復作用（darkrepair）1、由核酸內切酶切開二聚體的5’末端，形成3’-OH和5’-P的單鏈缺口2、核酸外切酶從5’-P到3’-OH方向切除二聚體，并擴大缺口。3、DNA聚合酶以另一條互補鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起合成缺失片段。4、連接酶將新合成的3’-OH與原有的5’-P相連接。第七十七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第七十八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日紫外誘變方法設備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等，紫外燈：波長為253、7nm,功率是15W處理時的照射距離：20cm—30cm樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm照射時，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量。第七十九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日由于微生物接受的照射劑量與燈的功率、照射距離、照射時間、菌液濃度、菌液厚度、細胞本身特性等因素有關，所以單純用時間表示照射劑量并不完全可靠。一定的死亡率必定對應一定的照射劑量，所以，在實際應用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。通常先繪制照射時間與死亡率的關系曲線，然后選擇合適的劑量。生產上經常采用的劑量：死亡率為70%——80%左右。第八十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日重組修復必須在DNA復制的情況下進行，所以又叫復制后修復。細胞在不切除二聚體的情況下，以帶有二聚體的這條鏈為模板合成互補單鏈，但在每個二聚體附近留有一空隙。通過染色體交換，空隙部位就不在面對著胸腺嘧啶二聚體，而是面對著正常的單鏈，在這種條件下，DNA聚合酶和連接酶起作用將空隙部位進行修復，重組修復中的DNA損傷并沒有去除，但隨著微生物的傳代繁殖，損傷的比例逐漸降低。第八十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第八十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日誘變育種：是用物理或化學的誘變劑使誘變對象內的遺傳物質（DNA）的分子結構發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種具有極其重要的實踐意義。當前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產部門所使用的高產菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產性能的。（七）誘變育種第八十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日

誘變育種的步驟原始菌種純化斜面/肉湯培養(yǎng)單孢子/單細胞懸液誘變劑處理平板分離移至斜面小試中試初篩復篩計算存活率觀察形態(tài)變異，挑單菌落良種保藏原菌種特性鑒定第八十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日誘變育種的基本過程選擇選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選↓保藏和擴大試驗第八十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日

1.出發(fā)菌株的選擇

出發(fā)菌株———用來育種處理的起始菌株

◆出發(fā)菌株應具備：

①對誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產性狀的能力或潛力；

◆出發(fā)菌株的來源；

①自然界直接分離到的野生型菌株：

②歷經生產考驗的菌株：

③已經歷多次育種處理的菌株：第八十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日2.制備細胞懸液

要求：

①菌體處于對數(shù)生長期，并使細胞處于同步生長；

②細胞分散且為單細胞，以避免表型遲延現(xiàn)象（phenotypiclag）;

方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐溫80（表面活性劑）

③用無菌脫脂棉過濾。

制備：

物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學誘變劑——緩沖液

濃度：

細菌、放線菌108個/ml

霉菌、酵母菌106個/ml第八十七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日表型遲延現(xiàn)象:指某一突變在DNA復制和細胞分裂后，才在表型上顯示出來，造成不純的菌落。產生原因：①分離性遲延現(xiàn)象;②生理性遲延現(xiàn)象

3.誘變處理

誘變劑的作用：①提高突變的頻率②擴大產量變異的幅度③使產量變異朝著正突變或負突變移動

劑量的表示法：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應預先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量?！滤缆适亲詈玫恼T變劑相對劑量的表示方法。

最適劑量的選擇：產量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在70～80%）第八十八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日選擇誘變劑的種類：在選用理化因子作誘變劑時，在同樣效果下，應選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。簡便有效的誘變方法：紫外線的照射最為方便。化學誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是中止反映的方法很多，實際工作時可參看有關書籍。一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細胞，然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經培養(yǎng)后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長出許多單菌落，最后可用影印培養(yǎng)法或逐個檢出法選出突變種。第八十九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日誘變處理方式：

單一因子處理：復合因子處理：先后使用同時使用單一因子重復使用兩種以上因素第九十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日4.菌種篩選4.1篩選方案：實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復篩兩步進行。初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網；——因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應盡可能快速、簡單。復篩的目的：確認符合要求的菌株；——復篩以質為主，應精確測定每個菌株的生產指標。篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.常用誘變劑的使用方法第九十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日可見，設計和采用效率高的篩選方案和方法極其重要以選育高產突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下第九十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第一輪：一個出發(fā)菌株→→→選出200個菌株→→→選出50株→→→選出5株誘變處理初篩（每瓶一株）復篩（每瓶四株）第二輪：5個出發(fā)菌株→→→→→→選出50株→→→選出5株40株40株40株40株40株誘變處理初篩復篩（每瓶一株）（每瓶四株）第九十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日4.2變異菌的一般篩選方法4.2.1平皿快速檢測法變色圈法透明圈法生長圈法抑菌圈法梯度平板法4.2.2搖瓶培養(yǎng)法第九十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日以溫度敏感突變?yōu)槔汉Y選方法：用途：常用于提高代謝物產量原因：是由于某一酶蛋白結構改變后，在高溫下活力喪失重要性：如果此酶為蛋白質、核酸合成途徑中所需的酶，則此變異株在高溫下的表型就是營養(yǎng)缺陷型。4.3.1條件抗性突變型的篩選4.3特殊變異菌的篩選方法第九十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日在富含生物素的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵時：先在30℃（允許條件）中進行培養(yǎng)以得到大量菌細胞，適當時間后提高溫度（40℃，非允許條件），即能獲得谷氨酸的過量生產。應用舉例由谷氨酸產生菌乳糖發(fā)酵短桿菌2256，經誘變處理得到溫度敏感變異株Ts88:30℃培養(yǎng)時能正常生長40℃是死亡，但能在富含生物素的培養(yǎng)基中積累谷氨酸（而野生型卻受生物素的反饋抑制）。第九十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日方法：梯度平板法（gradientplate）4.3.2抗藥性突變株的篩選抗藥性突變株的應用：作為菌株的遺傳標記作為生產菌種（結構類似物抗性變異株）第九十七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日4.3.3抗生素抗性變異株的篩選第九十八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日

★與營養(yǎng)缺陷突變有關的三類遺傳型個體：營養(yǎng)缺陷型：經誘變產生的一些合成能力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)基內加入相應有機養(yǎng)分才能正常生長的變異菌株。如：lys-，bio-

野生型：自然界分離到的任何微生物，在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為該微生物的野生型。

如：lys+;bio+;原養(yǎng)型：指營養(yǎng)缺陷型突變菌株回復突變或重組后產生的菌株，與野生型的表型相同。

4.3.4營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選第九十九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關的三類培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（MM）[-]：凡是能滿足野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）[+]：滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株生長的天然或半合成培養(yǎng)基。

補充培養(yǎng)基（SM）[x]：在MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應營養(yǎng)缺陷型菌株生長的合成培養(yǎng)基。第一百頁，共一百九十頁，2022年，8月28日營養(yǎng)缺陷型誘變篩選步驟及方法auxo的鑒定

誘變處理auxo的濃縮auxo的檢出第一百零一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日缺陷型的濃縮①抗生素法原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細胞，對休止態(tài)細胞無作用。方法：將菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基中第一百零二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日②菌絲過濾法適用于：絲狀（放線菌、霉菌）原理：基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲；auxo孢子可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。第一百零三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日①逐個檢出法缺陷型的檢出第一百零四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日

②影印平板培養(yǎng)法第一百零五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日③夾層培養(yǎng)法第一百零六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日①生長譜法方法簡便；回變和污染不影響結果測定物質可為粉末或紙片

缺陷型的鑒定測定一般應分兩階段：第一階段：測定是哪類物質的缺陷型；第二節(jié)段：根據(jù)第一階段確定的范圍，進一步確定是哪種具體化合物的缺陷型；第一百零七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日組合營養(yǎng)物法步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）：a.將多種營養(yǎng)因子編組；b.將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；c.結果分析；一組：1

2345

二組：26

789

三組：3710

1112

四組：4811

1314

五組：59121415營養(yǎng)因子分組編排時注意；1）每組內無重復的營養(yǎng)因子2）每組中應包含只出現(xiàn)一次的因子3）每組中其他因子應分別出現(xiàn)二次如：第一百零八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日一組：1

2345

二組：26

789

三組：3710

1112

四組：4811

1314

五組：59121415第一百零九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日②組合補充培養(yǎng)基法將待測的菌點種到各種補充培養(yǎng)基上，逐個分析各菌的缺陷類型，或快速分離出所需缺陷類型的菌株。ABFEDCHG第一百一十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日缺陷型的應用作為菌株的遺傳標記：進行基因工程、誘變育種、研究代謝過程時用作親本標記；作為生產菌種：aa、核苷酸等生產菌種；作為aa、維生素、堿基的測定菌株。第一百一十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日Amestest：對化學誘變劑做檢測菌種：鼠傷寒沙門氏菌his-；原理：his-在基本培養(yǎng)基上不長；而發(fā)生回復突變則長。第一百一十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日Amestest方法示意圖第一百一十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日第三節(jié)基因重組定義：凡把兩個不同性狀個體內的遺傳基因轉移到一起，經過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（generecombination）或遺傳重組。作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產生新遺傳型的個體。重組與雜交的關系：重組是分子水平上的一個概念，可以理解成是遺傳物質分子水平上的雜交而一般所說的雜交（hybridization）則是細胞水平上的一個概念。雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。真核微生物中的有性雜交、準性雜交（parasexualhybridization）等及原核生物中的轉化、轉導、接合和原生質體融合等都是基因重組在細胞水平上的反映。第一百一十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日微生物中各種形式基因重組的比較重組范圍供體和受體的關系 整套染色體局部雜合高頻率低頻率部分染色體個別或少數(shù)基因細胞融合或聯(lián)結性細胞真菌的有性生殖體細胞真菌的準性生殖細胞間暫時溝通細菌的接合性導細胞間不接觸吸收游離DNA片段轉化噬菌體攜帶DNA轉導由噬菌體提供遺傳物質完整噬菌體溶源轉變噬菌體DNA轉染第一百一十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日基因重組的意義基因重組是雜交育種的理論基礎。雜交育種的優(yōu)點：①由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，因此，不論在方向性還是自覺性方面，均比誘變育種前進了一大步。②利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經過長期誘變處理后所出現(xiàn)的產量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。雜交育種的缺點：由于雜交育種的方法較復雜，工作進展較慢，還很難像誘變育種技術那樣得到普遍的推廣和使用，尤其在原核生物的領域中，應用轉化、轉導或接合等重組技術來培育可應用于生產實踐上的高產菌株的例子還不多見。到了70年代后期，由于原生質體融合技術獲得巨大的成功后，才使重組育種技術獲得了飛速的發(fā)展。第一百一十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日生長快、產量低生長慢、產量高基因重組生長快、產量高第一百一十七頁，共一百九十頁，2022年，8月28日一、原核微生物的基因重組基因重組的方式轉化轉導接合原生質體融合第一百一十八頁，共一百九十頁，2022年，8月28日

R型活菌+S型死菌→→S型活菌定義：受體菌自然或在人工技術作用下直接攝取來自供體菌的游離DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉移過程，稱為轉化。轉化后的的受體菌稱為轉化子（transformant）。有關名詞：受體菌：recipient/receptor，轉化基因的接受者供體菌：donor，轉化基因的提供者轉化因子：來自供體菌的DNA片段轉化子：transformant，將轉化基因重組進入自身染色體組的重組子（一）轉化（transformation）1、轉化及其發(fā)現(xiàn)第一百一十九頁，共一百九十頁，2022年，8月28日

①受體細胞要處于感受態(tài).感受態(tài)：competence，受體細胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實現(xiàn)其轉化的一種生理狀態(tài)②供體DNA片段（轉化因子）大小適宜，分子量一般為1×107

D左右③菌株間的親緣關系密切2、轉化發(fā)生的條件

3、轉化的類型根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為：①自然遺傳轉化naturalgenetictransformation②人工轉化artificialtransformation第一百二十頁，共一百九十頁，2022年，8月28日

感受態(tài)出現(xiàn)時間：只在細菌生長的某一時期出現(xiàn)；不同菌種的感受態(tài)出現(xiàn)在不同生長時期Streptococcuspneumoniae的感受態(tài)出現(xiàn)在生長曲線中的指數(shù)期的中期，Bacillus的一些種則往往出現(xiàn)在指數(shù)期末及穩(wěn)定期的初期。感受態(tài)由細胞的遺傳性決定，但同時也受環(huán)境因子的影響：cAMP、Ca2+等最明顯。如用CaCl2處理E.coli可以誘發(fā)其產生感受態(tài)。感受態(tài)細胞的比例：當處于感受態(tài)高峰時，群體中呈感受態(tài)的細胞因菌種而不同.Bacillussubtilis不超過10~15%Streptococcuspneumonia和Haemophilusinfluenzae（流感嗜血桿菌）達到100%轉化DNA的最低濃度：在群體中含有15%感受態(tài)細胞時，0.1gDNA/ml細胞懸液即可有效發(fā)生轉化第一百二十一頁，共一百九十頁，2022年，8月28日感受態(tài)因子：細胞外蛋白，Streptococcuspneumonia和Bacillus中分離的分子量為5,000~10,000Dalton，可能存在于細胞膜上，可催化外來DNA分子的吸收或降解細胞表面某種成分，以讓細胞表面的DNA受體顯露出來；也可能是一種自溶酶。對不同細菌，每個細胞上的DNA結合位點數(shù)不同。有人計算，在H.Influenzae上有4~10個，而在S.Pneumonia上則有30~80個。S.Pneumonia的感受態(tài)細胞中提取的感受態(tài)因子可使同菌株的非感受態(tài)細胞變成感受態(tài)的，而Bacillussubtilis的感受態(tài)因子則無此功能。第一百二十二頁，共一百九十頁，2022年，8月28日轉化因子轉化因子：本質是供體DNA片段一般的轉化因子都是線狀雙鏈DNA；也有少數(shù)報道認為線狀單鏈DNA也有轉化作用。大?。航涍^多次提純操作后，每一轉化DNA片段的分子量都小于1×107，即約占細菌核染色體組的0.3%，其上平均約含15個基因。而粗制的DNA則分子量較大。吸收數(shù)量：每個感受態(tài)細胞約可摻入10個轉化因子。轉化頻率：一般只有0.1~1%，最高時亦達10%左右。據(jù)研究，呈質粒形式（雙鏈閉合環(huán)狀）的轉化因子，其轉化頻率最高（因為它進入受體菌中后，可不必與受體染色體進行交換、整合即可進行復制和表達）。第一百二十三頁，共一百九十頁，2022年，8月28日轉化的過程以S.Pneumoniastrr（肺炎鏈球菌抗鏈霉素菌株）為例，大致可分為六階段：吸附：雙鏈DNA片段與細胞表面的特定位點（主要在新形成細胞壁的赤道區(qū)）結合，此時，細胞膜上的膽堿可促進這一過程。在吸附過程的前階段，如外界加入DNA酶，就會減少轉化子的產生。稍后，DNA酶即無影響，說明此時該轉化因子已進入細胞；切割：在吸附位點上的DNA被核酸內切酶分解，形成平均分子量為4~5×106的DNA片段；入胞：DNA雙鏈中的一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進入細胞，這是一個耗能的過程。分子量小于5×105的DNA片段不能進入細胞。這時如用低濃度溶菌酶處理，因它提高了細胞壁的通透性，故可提高轉化頻率；重組：來自供體菌的單鏈DNA片段在細胞內與受體細胞核染色體組上的同源區(qū)配對，接著受體染色體組上的相應單鏈片段被切除，并被外來的單鏈DNA交換、整合和取代，于是形成了一個雜合DNA區(qū)段（heterozygousregion）。在這一過程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA連接酶的參與；復制：受體菌的染色體組進行復制，雜合區(qū)段分離成兩個，其中之一獲得了供體菌的轉化基因，另一個未獲供體基因；轉化子形成：當細胞發(fā)生分裂后，一個子細胞含供體基因，這就是轉化子；另一個細胞與原始受體菌一樣。第一百二十四頁，共一百九十頁，2022年，8月28日降解吸附切割成4~5×106單鏈入胞同源部分配對、整合復制分裂，只有一個子代DNA分子獲得供體基因非轉化子轉化子第一百二十五頁，共一百九十頁，2022年，8月28日轉化的過程strrstrr第一百二十六頁，共一百九十頁，2022年，8月28日自然轉化的普遍性到目前為止，已發(fā)現(xiàn)能發(fā)生轉化作用的菌屬主要有：Streptococcuspneumoniae、Haemophilus（嗜血桿菌屬）、Bacillus、Neisseria（奈瑟氏球菌屬）、Rhizobium（