超臨界法萃取青蒿素和HPLC檢測

一．實(shí)驗(yàn)原理

(一)超臨界萃取的基本原理

1．什么是超臨界流體萃取技術(shù)？

以超臨界流體作萃取劑，利用它對溶質(zhì)具有特異增加的溶解能力的特性，將其從液體或固體中萃取到超臨界流體中，然后通過降壓或升溫析出產(chǎn)物的分離過程。Ⅰ用超臨界法從青蒿中萃取青蒿素超臨界流體是處于特定的超臨界溫度和壓力下的流體。任何物質(zhì)均具有特有的臨界溫度Tc和臨界壓力Pc；在T＞Tc、P＞

Pc

條件下存在的物質(zhì)稱為超臨界流體；它們處于既非液體也非氣體的超臨界狀態(tài)，是介于氣體和液體之間的一種特殊的聚集狀態(tài)。2.

什么是超臨界流體？密度g/mL黏度g/(cm?s)擴(kuò)散系數(shù)cm2/s氣體(101.3KPa,15~30℃)超臨界流體(Tc,Pc)液體(15~30℃)(0.6~2)×10-3

0.2~0.50.6~1.6(1~3)×10-4(1~3)×10-4(0.2~3)×10-20.1~0.40.7×10-3(0.2~3)×10-5超臨界流體與氣體和液體的物性比較超臨界流體的密度比普通氣體大數(shù)百倍，近似于液體。黏度比液體小，接近于氣體。擴(kuò)散系數(shù)比液體大。

∴超臨界流體既具有液體溶解度大的性質(zhì)，又具有氣體易擴(kuò)散、傳質(zhì)速度高的優(yōu)點(diǎn)。

3.

超臨界流體的特性4.超臨界流體的溶解性能由相圖可見：臨界區(qū)附近，密度線聚集于臨界點(diǎn)周圍，故流體密度隨壓力和溫度的變化十分敏感，導(dǎo)致溶解度相應(yīng)地變化。溶質(zhì)的溶解度與流體密度大致成正比。

∴改變壓力或溫度改變流體密度改變?nèi)苜|(zhì)溶解度超臨界壓力↑流體密度↑溶質(zhì)溶解度↑超臨界壓力↓流體密度↓溶質(zhì)溶解度↓(或升高溫度)萃取產(chǎn)物解析

常用的超臨界萃取劑：乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、乙烯、氨氣、CO2、SO2

CO2應(yīng)用最廣，優(yōu)點(diǎn)：

1.它的臨界點(diǎn)較低：Tc=31.06℃，Pc=7.38MPa，特別是臨界溫度接近常溫，可防止熱敏性物質(zhì)的氧化和降解；

2.臨界密度(0.448g/cm3)是超臨界溶劑中最高的，故萃取能力強(qiáng)，提取率高；

3.無毒、穩(wěn)定性好、不易燃、價廉、易于回收。(二)超臨界流體萃取的基本操作制備超臨界流體(控制一定的壓力和溫度)萃取高壓流體(含產(chǎn)物)降壓升溫初級分離(析出殘?jiān)碗s質(zhì))降壓調(diào)溫二級分離(析出目標(biāo)產(chǎn)物)CO2氣體超臨界流體萃取的流程簡圖

匯合器CO2鋼瓶凈化器冷凝器壓縮泵預(yù)熱器萃取釜進(jìn)料預(yù)熱器預(yù)熱器分離釜1分離釜2物理性狀：無色針狀結(jié)晶，味苦，熔點(diǎn)156-157℃，比旋度[α]17D+66.3℃(C=1.64，氯仿)。來源和用途：由黃花蒿(又名青蒿)中分離而得。為一種抗瘧藥物，具有高效、低毒、速效等特點(diǎn)，主要作用于瘧原蟲的紅內(nèi)期。目前，該藥物在瘧疾發(fā)病率很高的東南亞地區(qū)得到廣泛的應(yīng)用。1.利用超臨界CO2流體萃取，萃取溫度低，并有惰性氣體保護(hù)，防止了青蒿素的氧化和破壞。2.萃取和分離合二為一，提高了生產(chǎn)效率和節(jié)約了能耗。3.提取過程中免除了傳統(tǒng)方法中的有機(jī)溶劑，成品中沒有有機(jī)溶劑殘留，保持了萃取物的全天然性。4.整個過程不產(chǎn)生“三廢”，不會對環(huán)境造成污染。

(四)超臨界萃取青蒿素的優(yōu)點(diǎn)二.操作方法（一）青蒿粉末的制備：青蒿原料粉碎機(jī)*間歇運(yùn)作，防止電機(jī)過熱青蒿粉末電子臺稱稱取

g裝入萃取釜*裝量約為80%超臨界萃取設(shè)備流程圖（三）系統(tǒng)預(yù)熱打開：電源開關(guān)各預(yù)熱開關(guān)制冷機(jī)開關(guān)設(shè)置預(yù)熱溫度：萃取釜40℃分離器160℃分離器250℃預(yù)熱至設(shè)定溫度后開機(jī)預(yù)熱1萃取釜預(yù)熱2分離1預(yù)熱3分離240℃60℃50℃（四）開機(jī)和萃取操作匯合器凈化器冷凝器預(yù)熱1預(yù)熱2預(yù)熱3J7主泵放氣閥萃取釜40℃J5J6萃取釜排氣閥J11分離160℃J16分離250℃J19J20J2318MPa14MPa6MPaCO2鋼瓶停機(jī)操作匯合器凈化器冷凝器預(yù)熱1出渣預(yù)熱2預(yù)熱3J7萃取釜40℃J5J6萃取釜排氣閥J11分離160℃J16出料分離250℃J19出料成品J20J2318MPa14MPa6MPaCO2鋼瓶Ⅱ高效液相色譜法(HPLC)檢測青蒿素含量一．實(shí)驗(yàn)原理

HPLC原理：利用樣品分子在固定相（填料柱）和流動相之間相互作用力大小不同而實(shí)現(xiàn)分離。高壓可提高溶質(zhì)組分移動速度。作用力固定相流動相移動速度保留時間A組分B組分

大小

小大

慢長

快短

按溶質(zhì)組分與固定相之間的作用機(jī)理分類：①吸附分配作用：反相、正相和疏水性色譜；②電荷作用：不同類型的離子交換色譜；③空間排阻作用：凝膠過濾和凝膠滲透色譜；④生物特異性作用：親和色譜。流動相——極性溶劑；固定相——非極性填料組分性質(zhì)作用力固定相流動相移動速度保留時間A組分B組分非極性強(qiáng)非極性弱大小小大

慢長

快短青蒿素堿性溶液定量生成α?β—不飽和酮酸鹽

酸化穩(wěn)定的化合物，在260nm處有吸收峰，可用高效液相色譜紫外法檢測。二.操作方法（一）溶液配制1．0.2%NaOH溶液500ml：稱取1.00gNaOH去離子水溶解

500ml；2．0.08mol/L醋酸溶液：

吸取冰醋酸2.30ml去離子水500ml

3．0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4pH7.0緩沖液（流動相）：稱取Na2HPO4·12H2O固體1.79g蒸餾水

500ml

稱取NaH2PO4·12H2O固體0.68g蒸餾水500ml混合，調(diào)pH7.04.

1.00mg/ml青蒿素標(biāo)準(zhǔn)液：精確稱取50.0mg青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品無水乙醇

50ml（容量瓶）5.

樣品液：分別精確稱取青蒿素粗品50、100、150mg于10ml具塞試管中無水乙醇5ml

超聲波振蕩促溶→轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中

無水乙醇10ml（二）操作條件色譜柱：C18反相高效液相色譜柱；流動相：

0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4，pH7.0緩沖液:甲醇=55:45

波長：260nm；流速：0.8ml/min；柱壓：30MPa

進(jìn)樣量：20μl

停止時間：30min恒流泵A恒流泵B紫外檢測儀A液水相B液有機(jī)相LC-100液相色譜儀

進(jìn)樣器色譜柱液相色譜儀的啟動順序：打開排空閥，抽出流動相，排除空氣打開高壓泵和檢測器的電源開關(guān)，檢測器自動開始自檢啟動電腦；插入U盤，軟件自動初始化；設(shè)置波長。

設(shè)置總流量、A和B兩液的比例、泵壓、啟動泵。設(shè)置自動停止時間、各項(xiàng)屏顯參數(shù)、文件名及保存路徑。

先通入流動相沖洗管路系統(tǒng)，基線走直后，進(jìn)樣20μl

外標(biāo)法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：已知樣校正法（單點(diǎn)校正法）：配制一個與被測組分濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)液，在完全相同的條件下進(jìn)樣，由下式計(jì)算樣品組分的濃度：儀器的清洗*進(jìn)樣完畢后，必須將管路、泵和進(jìn)樣閥沖洗干凈。

流動相為緩沖液的水相（A泵）清洗方法：

用100%凈水沖洗45min除去緩沖液

甲醇/水（90:10）的混合液清洗40min用HPLC級甲醇沖洗泵和進(jìn)樣閥30min

色譜柱存放時，柱內(nèi)應(yīng)充滿HPLC級甲醇或乙腈儀器關(guān)閉順序：按下“泵停止”按鈕按下氘燈“關(guān)”按鈕

退出電腦工作站軟件

關(guān)閉高壓恒流泵和紫外檢測器的電源開關(guān)。注意事項(xiàng)超臨界萃取壓力較高，請注意安全，未經(jīng)許可，不得擅自亂動閥門、開關(guān)；使用超臨界萃取設(shè)備必須先熟悉流程，嚴(yán)格按操作規(guī)程操作；分析操作中，每次加入溶液后必須立即搖勻；HPLC進(jìn)樣操作時，注射器吸液后應(yīng)先倒置，排出空氣；必須侍基線走直后，才能進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總：標(biāo)準(zhǔn)樣______mg標(biāo)準(zhǔn)液濃度_____mg/ml；粗品樣_______mg樣品編號

1#2#3#4#5#6#標(biāo)樣稱重

mg峰面積（微伏·秒

）譜圖QAS含量mg/mlQAS總量mg粗品中QAS含量