胚胎和配子生物工程(1)

(Embryonicandgametalbioengineering)

9.1概述

一、胚胎移植的含義

胚胎移植技術(shù)—ET（embryotransfer）胚胎移植：將一頭良種母畜（供體）配種后的早期胚胎取出，移植到另一頭同種（受體）的生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi)，使胚胎繼續(xù)發(fā)育成為新個(gè)體，俗稱借腹懷胎。.提供胚胎的個(gè)體為“供體”，接受胚胎的個(gè)體為“受體”，不管供體還是受體動(dòng)物都應(yīng)為雌性個(gè)體。胚胎移植的實(shí)質(zhì)

胚胎移植實(shí)質(zhì)上是早期胚胎在相同生理環(huán)境條件下空間位置的轉(zhuǎn)換，而胚胎本身的遺傳物質(zhì)并不發(fā)生改變，因此各種性狀均能保持其原來(lái)的優(yōu)良特性。為什么胚胎移植能成功?移動(dòng)到任何一頭動(dòng)物子宮內(nèi)都能發(fā)育嗎?同種動(dòng)物發(fā)情排卵后,在一段時(shí)間內(nèi)供體\受體具有相同的生理環(huán)境為什么能收集到胚胎?早期胚胎一定時(shí)間內(nèi)處于游離狀態(tài)供體和受體會(huì)不會(huì)發(fā)生排斥/同種動(dòng)物之間基本上不排斥為什么移植的胚胎能保留供體雙親的特性?胚胎雖然與受體有生理和組織上的聯(lián)系,但遺傳特性不受受體的影響.生理學(xué)基礎(chǔ)流程圖.激素經(jīng)受體產(chǎn)生更多后代示意圖.對(duì)供體\受體的選擇和處理配種或人工授精對(duì)胚胎的收集\檢查\培養(yǎng)\保存移植胚胎移植后檢查

(1)對(duì)供、受體的選擇，用促性腺激素進(jìn)行同期發(fā)情處理

↓

(2)用激素對(duì)供體母牛做超數(shù)排卵處理(對(duì)供體注射促性腺激素，促進(jìn)排卵)

↓

(3)選擇同種優(yōu)秀的公牛進(jìn)行配種或人工授精(多個(gè)卵子與多個(gè)精了結(jié)合形成多個(gè)受精卵，受精的部位在輸卵管)；受精卵→卵裂→早期胚胎

↓(4)胚胎收集(特制的沖卵裝置從母體子宮中沖出胚胎)

步驟

↓

(5)對(duì)胚胎質(zhì)量檢查(此時(shí)的胚胎處于桑椹期或囊胚期)

↓

(6)胚胎移植或保存(保存條件：-196℃的液氮)

↓

(7)胚胎移植操作方法(手術(shù)法和非手術(shù)法)

↓

(8)對(duì)受體母牛進(jìn)行是否妊娠的檢查

↓ (9)體內(nèi)孕育，產(chǎn)下胚胎移植的犢牛２、超數(shù)排卵和人工授精PMSG+PGF2а法：

在母牛發(fā)情期第8—12天，肌注PMSG2000單位，48小時(shí)后，肌注15-甲基前列腺素4mg。發(fā)情后12小時(shí)進(jìn)行第一次輸精；第一次輸精后8小時(shí)進(jìn)行第二次輸精?，F(xiàn)在使用的超數(shù)排卵的方法一般為ＦＳＨ＋ＰＧ法；具體操作方法為：在供體牛發(fā)情后的９－１２天，經(jīng)檢查黃體較好的牛，采用四天減量注射ＦＳＨ的方法；羊：發(fā)情周期的第12-15天，促性腺激素處理的第二天或第三天，注射PG③為什么在９－１２天開始？④為什么要使用ＰＧ？牛超數(shù)排卵時(shí)間表供體母畜的配種必須用優(yōu)秀的種公畜進(jìn)行多次配種，一般隔8-12小時(shí)進(jìn)行一次配種，直到發(fā)情結(jié)束。配種前應(yīng)對(duì)種公畜的精液進(jìn)行質(zhì)量檢查?？蓛?yōu)秀種公畜不足時(shí)，可考慮首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。供體配種3、胚胎回收（沖胚）①牛胚胎回收（沖胚）：在牛發(fā)情后（發(fā)情之日計(jì)為第0天）的第七天采用非手術(shù)法回收胚胎。②一般供體牛每?jī)蓚€(gè)月超排一次，平均每次超排能獲得可用胚胎6-7枚。在新疆的最高記錄是一頭牛一次超排獲得48枚可用胚胎。③沖胚所用的液體為PBS液，其主要成分有：Nacl、Kcl、KH2PO4、Mgcl2.6H2O、Na2HPO4、丙酮酸鈉、葡萄糖、牛血清白蛋白、青霉素、鏈霉素④無(wú)菌操作的重要性移胚

供體羊胚胎收集收集到的沖洗液靜置，沖洗液分離。揀胚：將胚胎移至培養(yǎng)液或保存液中。胚胎鑒定：根據(jù)透明帶、胚胎細(xì)胞、發(fā)育階段及細(xì)胞在透明帶中的比例確定胚胎級(jí)別。4.胚胎的檢查收集到的沖冼液，需靜置10min，使胚胎下沉到容器底部，然后移去上清液，再放于解剖鏡下檢查胚胎的數(shù)量和發(fā)育情況，再將發(fā)育正常的胚胎收集到注射器或移植管內(nèi)供移植用。胚胎的檢查項(xiàng)目：1.受精卵整體的形態(tài)和體積大??；2.透明帶形狀，厚度及損傷程度；3.發(fā)育正常胚胎的卵裂球應(yīng)該具有整齊的外形，大小一致，分布均勻而緊密，發(fā)育速度與胚齡一致；4.卵細(xì)胞表面顆粒的狀態(tài)和多少等。4.胚胎的檢查4、胚胎質(zhì)量鑒定牛胚胎大小直徑約為0.15-0.16mm（第七天）一般分為A、B、C三個(gè)等級(jí)A級(jí)：胚胎形態(tài)完整，輪廓清晰，分裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊，無(wú)附著的細(xì)胞和液泡或很少；B級(jí)：輪廓清晰，色調(diào)及細(xì)胞密度好，可見到一些附著的細(xì)胞和液泡；C級(jí)：輪廓不清晰，色調(diào)發(fā)暗，結(jié)構(gòu)較松散，游離的細(xì)胞和液泡較多。目前，胚胎的發(fā)育階段采用以下系統(tǒng)來(lái)劃分牛的異常胚胎示意圖1～2級(jí)牛胚胎6天收集的胚胎（未揀）二細(xì)胞至四細(xì)胞胚胎

胚胎的降溫：使胚胎停止發(fā)育，延長(zhǎng)其體外生存時(shí)間體外培養(yǎng)：將胚胎置于體溫條件下，在培養(yǎng)液中，使其繼續(xù)發(fā)育胚胎冷凍：通過一定的處理程序，將胚胎降溫冷凍后，保存于液氮中5.胚胎的保存6、胚胎冷凍胚胎冷凍的難點(diǎn)：冷凍液的毒副損傷降溫過程的冷凍損傷三步平衡冷凍法胚胎分別用含3%、6%、10%甘油且含10%牛血清的PBS液的保存液浸漬5分鐘后，用含10%甘油的PBS裝管冷凍。一步法冷凍胚胎用含10%血清的乙二醇溶液平衡后直接冷凍牛胚胎冷凍程序示意圖7、受體的同期發(fā)情處理自然發(fā)情（妊娠率更高）一次同期法（PG）（妊娠率較低）兩次同期法（PG）（妊娠率更高）11天內(nèi)注射兩次PG發(fā)情觀察極為重要手術(shù)法移植非手術(shù)法移植7.胚胎移植受體移胚7、胚胎移植受體牛發(fā)情后的第七天經(jīng)檢查黃體合格后移植對(duì)黃體的要求？移植步驟主要有：直腸檢查、解凍胚胎檢查、胚胎裝管、麻醉、移植胚胎裝管

牛胚胎的移植采用非手術(shù)法，用移植槍將胚胎移入子宮角的前端。7、胚胎移植供體和受體的抗炎處理健康狀況檢查返情狀況檢查妊娠檢查及妊娠確定8.胚胎移植后觀察及處理9、妊娠診斷1、乳汁孕酮