分子熒光分光光度分析第_章第二章第三章第_章第二章第三章熒光分析基本原理熒光分光光度計(jì)定性與定量分析第一章熒光分析基本原理第一節(jié)熒光產(chǎn)生與測(cè)量第二節(jié)熒光參數(shù)第三節(jié)熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系第四節(jié)影響熒光測(cè)量的因素第一節(jié)熒光產(chǎn)生與測(cè)量第一節(jié)熒光產(chǎn)生與測(cè)量一、 分子能級(jí)二、 熒光產(chǎn)生三、 磷光產(chǎn)生熒光測(cè)量分子能級(jí)分子的結(jié)構(gòu)比原子復(fù)雜，最簡(jiǎn)單的雙原子分子，有配對(duì)電子形成化學(xué)鍵維系其結(jié)構(gòu)，大多數(shù)分子有偶數(shù)個(gè)電子，每個(gè)軌道中的電子自旋相反，這種分子狀態(tài)稱(chēng)為單線(xiàn)態(tài)。當(dāng)分子價(jià)電子被激發(fā)后，電子自旋取向有兩種。與低能級(jí)電子自旋方向相反，為單線(xiàn)態(tài)；與低能級(jí)電子自旋方向相同，為三線(xiàn)態(tài)（亦稱(chēng)三重態(tài)）。單線(xiàn)態(tài)與三線(xiàn)態(tài)性質(zhì)不同，單—單線(xiàn)態(tài)躍遷幾率大，激發(fā)態(tài)平均壽命108So單—三線(xiàn)態(tài)躍遷幾率小,激發(fā)態(tài)平均壽命可達(dá)1SO

二、熒光的產(chǎn)生分子熒光是一種光致發(fā)光，與紫外吸收過(guò)程相反。在室溫下，大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，當(dāng)吸收特征頻率光（激發(fā)光）后，可以激發(fā)到第一、二電子激發(fā)態(tài)單線(xiàn)態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能A| 禺久3級(jí)的各個(gè)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)（吸收光譜），通過(guò)無(wú)輻射躍遷（內(nèi)轉(zhuǎn)換）,回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后，再躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)，以光的形式弛豫便產(chǎn)生熒光。分子熒光為單―單線(xiàn)態(tài)躍遷，熒光壽命僅10“s,激發(fā)光消失，熒光立即消失。從熒光的產(chǎn)生可看出:分子熒光的產(chǎn)生是由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)開(kāi)始，與熒光分子被激發(fā)到哪個(gè)能級(jí)無(wú)關(guān)，故熒光光譜形狀與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。熒光發(fā)射之前經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)換損失一部分能量，熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)。三、磷光的產(chǎn)生根據(jù)洪特規(guī)則，在不同軌道上有兩個(gè)自旋相同電子的分子能量（三形態(tài)），低于同一軌道上有兩個(gè)自旋相反電子的分子能量（單線(xiàn)態(tài)）。因此，在太陽(yáng)的分子軌道上,處于三線(xiàn)態(tài)分子的能量低于單線(xiàn)態(tài)分子。但是，處于第一電子激發(fā)三線(xiàn)態(tài)的一個(gè)振動(dòng)能級(jí)幾乎與第一電子激發(fā)單線(xiàn)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的能量相同。這樣，由第一電子激發(fā)單線(xiàn)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，有可能通過(guò)系間跨越，躍遷至第一電子激發(fā)三線(xiàn)態(tài)，再經(jīng)振動(dòng)弛豫躍遷至最低振動(dòng)能級(jí)，由此激發(fā)態(tài)躍遷至基態(tài)便產(chǎn)生磷光。從磷光的產(chǎn)生可知:磷光產(chǎn)生經(jīng)過(guò)系間跨越（自旋禁阻），發(fā)光速率較慢，激發(fā)光消失，磷光還能持續(xù)一定的時(shí)間，磷光壽命1070s。系間跨越損失部分能量，磷光波長(zhǎng)比熒光波長(zhǎng)長(zhǎng),比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)。熒光測(cè)量由于熒光是一種光致發(fā)光，激發(fā)光從一個(gè)方向射入,熒光向四方八方輻射。所以，熒光可以與照射光束呈90。方向測(cè)量熒光。與紫外分光光度法比較，熒光檢測(cè)背景黑暗,熒光強(qiáng)度F直接反映熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的強(qiáng)弱。而紫外吸光度大小是通過(guò)方向測(cè)量熒光。與紫外分光光度法比較，熒光檢測(cè)背景黑暗,熒光強(qiáng)度F直接反映熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的強(qiáng)弱。而紫外吸光度大小是通過(guò)透射光強(qiáng)I與入射光強(qiáng)厶比較得到的。從熒光測(cè)量方式可看出：①物質(zhì)紫外吸收系數(shù)一定，激發(fā)光越強(qiáng)，熒光發(fā)射越強(qiáng)，即Foc/oo②分子熒光強(qiáng)度與測(cè)量?jī)x器有關(guān)，提高熒光檢測(cè)靈敏度，可通過(guò)改善儀器性能，比較變態(tài)物質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度，需要對(duì)儀器進(jìn)行校正。熒光分析提高靈敏度途徑多，干擾因素也多。第一章熒光分析基本原理從熒光產(chǎn)生與測(cè)量可知：物質(zhì)分子吸收光是產(chǎn)生熒光的必要條件；磷光波長(zhǎng)大于熒光波長(zhǎng)，而二者的波長(zhǎng)都大于激發(fā)光波長(zhǎng)，磷光壽命長(zhǎng)于熒光。分子熒光強(qiáng)度F與吸光系數(shù)成正比，與激發(fā)光強(qiáng)度成正比。熒光強(qiáng)度檢測(cè)與儀器單色器光損失、狹縫寬度、檢測(cè)器靈敏度有關(guān)。大多數(shù)熒光物質(zhì)只有一個(gè)熒光譜帶，而吸收光譜有多個(gè)譜帶。第三節(jié)熒光參數(shù)第三節(jié)熒光參數(shù)一、 激發(fā)光譜二、 熒光發(fā)射光譜三、 熒光量子產(chǎn)率四、 熒光強(qiáng)度與總熒光量一、激發(fā)光譜熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜（瓦）是激發(fā)輻射在不同波長(zhǎng)處照射熒光分子，引起應(yīng)發(fā)射的相對(duì)效率?；蛘?，不同激發(fā)光（掃描入射光波長(zhǎng)）激發(fā)熒光分子發(fā)射某一波長(zhǎng)熒光（固定發(fā)射光波長(zhǎng)）的相對(duì)強(qiáng)度關(guān)系圖。熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光愈多，處于激發(fā)態(tài)的分子愈多,熒光發(fā)射愈強(qiáng)。反映了物質(zhì)對(duì)激發(fā)光吸收的狀況，的形狀與吸收光譜極為相似，與所選熒光波長(zhǎng)無(wú)關(guān),熒光波長(zhǎng)影響仗大小。直接掃描的Ex包含儀器光源、單色器的特性，稱(chēng)為表觀(guān)光譜。經(jīng)過(guò)校正的真實(shí)激發(fā)光譜與吸收光譜完全相同。

二、熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜（EQ是熒光物質(zhì)在某一激發(fā)波長(zhǎng)作用下，發(fā)射不同波長(zhǎng)熒光的相對(duì)效率圖。分子的吸收光譜與Em是分子價(jià)電子兩個(gè)不同躍遷方向的所產(chǎn)生的，由于分子的第一電子激發(fā)態(tài)與基態(tài)的振動(dòng)、激發(fā)光譜相同）呈鏡像2503302/nm400500轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)分布相似，Em與吸收光譜的第一吸收帶（與真實(shí)對(duì)稱(chēng)關(guān)系（頻率）。激發(fā)光波長(zhǎng)與呂?形狀無(wú)關(guān),影響盅的大小。激發(fā)光譜相同）呈鏡像2503302/nm400500三、熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率颯量子效率)是物質(zhì)熒光特性的主要參數(shù)，他表示物質(zhì)發(fā)射的本領(lǐng)，可表示為V發(fā)射量子數(shù) 發(fā)射量子數(shù)cT) 吸收量子數(shù)發(fā)射量子數(shù)+無(wú)輻射損失卩表明物質(zhì)吸收光是產(chǎn)生熒光的必要條件，表示充分條件，大多數(shù)有紫外吸收的物質(zhì)不發(fā)射熒光，其原因是卩太小。物質(zhì)Foe%卩與溫度、溶劑有關(guān)。分子的價(jià)電子躍遷過(guò)程中無(wú)輻射躍遷導(dǎo)致卩變小0

熒光強(qiáng)度與總熒光量從以上的分析中可知，熒光強(qiáng)度Foe"或厶、卩、憂(yōu)與單色器效率、狹縫寬度、檢測(cè)器靈敏度等相關(guān)的儀器系數(shù)）、熒光物質(zhì)濃度C。根據(jù)朗伯■比爾定律有I:.I=/010^c=厶以3必VAZ=/0-/=Z0（l-宀Lc）X23!=1-X+——3!2!當(dāng)兀VV1時(shí)，e-x^1-X,在熒光分析中，熒光物質(zhì)吸光量AZ不超過(guò)總?cè)肷涔獾?%時(shí)，或也c不大于0.05時(shí)，熒光強(qiáng)度可表示為F=k'XkX(PXM=k'XkX0XZ0[l-(l-2.3^Zc)]或F=K(t>IQsLc上式表明：poc(p、￡F*厶F當(dāng)也C不大于0.05、各常數(shù)一定時(shí)，F(xiàn)*c,樣液濃度很低時(shí)，F(xiàn)=Kc的線(xiàn)性關(guān)系越好。熒光測(cè)量是相對(duì)方法，影響因素較多。第三節(jié)熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系第三節(jié)熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系一、 有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)二、 物質(zhì)分子所處環(huán)境酚猷聯(lián)苯0二0.18茹0酚猷聯(lián)苯0二0.18茹0二1一、有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)1.分子碳架結(jié)構(gòu)熒光物質(zhì)分子均有共軌雙鍵結(jié)構(gòu)，且分子的共軌體系越大，非定域7T電子越容易被激發(fā)，越容易產(chǎn)生熒光。同時(shí)，熒光波長(zhǎng)向長(zhǎng)波紅移越多。任何影響療電子共轆結(jié)構(gòu)改變的因素，都將影響熒光量子效率，或影響熒光波長(zhǎng)紅移。第三節(jié)熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系第三節(jié)熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系無(wú)熒光 有熒光無(wú)熒光 有熒光2.分子幾何結(jié)構(gòu)從熒光分子結(jié)構(gòu)可看出，強(qiáng)熒光有機(jī)化合物分子，多數(shù)具有加大的剛性平面，一些具有有共輒體系、剛性平面不大的分子,與無(wú)機(jī)離子螯合CH2笏后，快出生熒光。剛性平面越穩(wěn)定、共轆體系越大，熒光效率越高。if聯(lián)二苯第三節(jié)熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系第三節(jié)熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系3.取代基位置芳香族化合物環(huán)上有不同取代基時(shí)，熒光強(qiáng)度和熒光光譜將會(huì)發(fā)生河大的變化加強(qiáng)熒光的有—OH、—OR、一NH、一NHR、一NR、-CN、-OCH3>-OC2H5等。消弱熒光的有-COOH、-c=o.-no2>-no、-sh、一F、一Cl、一Br、一I等。影響不明顯的有-R、-so3h.-niv等。二、物質(zhì)分子所處環(huán)境IE熒光分子所處溶液的pH影響分子的存在狀態(tài)，從而應(yīng)熒光強(qiáng)度的變化，甚至不發(fā)射熒光。IE例如，苯胺在pHV2的溶液中，無(wú)熒光；在pH7?12溶液中，具有藍(lán)色熒光；在pH>13的溶液中，無(wú)熒光。奎寧在O.lmol/L硫酸(I/2H2SO4)溶液中，具有強(qiáng)熒光,在O.lmol/L鹽酸溶液中，無(wú)熒光。此外，溫度影響分子異構(gòu)體變化、溶劑影響分子處在狀態(tài)、共存物質(zhì)的相互作用，均能使熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射發(fā)射變化。第四節(jié)影響熒光測(cè)量的因素第四節(jié)影響熒光測(cè)量的因素一、 激發(fā)光源與儀器系數(shù)二、 引起熒光淬滅的因素三、內(nèi)濾光與自吸收四、光散射影響五、溶劑影響六、pH影響七、溫度影響七、溫度影響八、其他干擾一、激發(fā)光源與儀器系數(shù)儀器光源在不同波長(zhǎng)區(qū)域發(fā)射強(qiáng)度是不同的，勢(shì)必影響熒光強(qiáng)度的測(cè)量。儀器光柵分光對(duì)不同波長(zhǎng)光的損失、狹縫寬度、檢測(cè)器靈敏度等儀器系數(shù)，在不同波長(zhǎng)處的影響不一樣,影響熒光強(qiáng)度的測(cè)量。強(qiáng)輻射光源照射樣品，引起熒光物質(zhì)的光分解，影響熒光強(qiáng)度測(cè)量。二、引起熒光淬滅的因素廣義講，任何使熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，都稱(chēng)為熒光淬滅。碰撞淬滅激發(fā)態(tài)分子發(fā)生非彈性碰撞，使激發(fā)態(tài)分子以非發(fā)光形式弛豫，均引起熒光淬滅。形成新的化合物溫度、溶劑效應(yīng)、pH值、金屬離子對(duì)熒光物質(zhì)分子的存在狀態(tài)產(chǎn)生影響，使熒光淬滅。轉(zhuǎn)入三線(xiàn)態(tài)常溫下，一般分子轉(zhuǎn)入三線(xiàn)態(tài)的幾率很小，含碘、漠以及硝基化合物、重氮化合物、竣基化合物、一些雜環(huán)化合物較容易轉(zhuǎn)入三線(xiàn)態(tài)，然后通過(guò)非彈性碰撞弛豫,釋放能量，引起熒光淬滅。發(fā)生電子轉(zhuǎn)移I>Bl、CN-等淬滅劑與熒光物質(zhì)分子碰撞時(shí)，易給出電子而使其還原，這樣改變了熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、取代基性質(zhì)，從而引起熒光淬滅。熒光物質(zhì)自淬滅自淬滅主要是溶液濃度過(guò)大，溶質(zhì)分子自身碰撞而聚合，改變熒光分子的構(gòu)象、構(gòu)型，引起熒光淬滅。此外，利用一些淬滅劑的熒光淬滅現(xiàn)象，可以進(jìn)行淬滅劑的間接測(cè)定。例如，樣分子可以使硼酸根?三苯乙醇酮絡(luò)合物的熒光淬滅，利用淬滅作用測(cè)量痕量氧。三、內(nèi)濾光與自吸收內(nèi)濾光是指溶液中存在能吸收激發(fā)光或熒光的物質(zhì),使熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光在溶液中被吸收，導(dǎo)致熒光發(fā)射減弱。例如，色氨酸測(cè)定時(shí)，溶液中混入少量重鉆酸鉀,色氨酸的熒光峰位287nm、348nm,重銘酸鉀吸收峰位287nm>370nmo如果以287nm作為熒光測(cè)定波長(zhǎng)，將出現(xiàn)內(nèi)濾光現(xiàn)象。一些吸收光譜與熒光光譜重疊的物質(zhì)，濃度較高時(shí),容易出現(xiàn)自吸收現(xiàn)象。蔥是典型的自吸收物質(zhì)。光散射影響在熒光分析中，激發(fā)光在溶液中的散射在熒光光譜中出現(xiàn)，干擾熒光光譜的測(cè)定、消弱熒光強(qiáng)度，影響熒光分析靈敏度。1.容器表面散射樣品池表面的劃痕對(duì)激發(fā)光散射，這種散射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)相同。掃描熒光光譜時(shí)，散射峰出現(xiàn)在于激發(fā)光波長(zhǎng)相同的位置。丁鐸爾散射丁鐸爾散射主要是溶液中膠體?；驓馀?，使激發(fā)光改變傳播方向，進(jìn)入檢測(cè)器產(chǎn)生信號(hào)，該散射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)相同。瑞利散射瑞利散射又稱(chēng)為分子散射。瑞利散射可能是溶液中溶質(zhì)分子、溶劑分子與光子的彈性碰撞，改變了入射光的傳播方向。也可能是非待測(cè)物質(zhì)分子振、轉(zhuǎn)能級(jí)躍遷吸收能量（無(wú)電子能級(jí)躍遷），釋放與吸收波長(zhǎng)相同的光。瑞利散射強(qiáng)度與波長(zhǎng)的4次方成反比o

4.拉曼散射拉曼散射是與瑞利散射類(lèi)似的又一種分子散射，它是由溶劑分子吸收激發(fā)光，躍遷到較高振動(dòng)能級(jí)，而后1-1是由溶劑分子吸收激發(fā)光，躍遷到較高振動(dòng)能級(jí)，而后1-1躍遷回稍高或稍低于原來(lái)的振動(dòng)能級(jí)時(shí)，發(fā)射比激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)（紅伴線(xiàn)）或較短（蘭伴線(xiàn)）的光。拉曼峰波數(shù)與激發(fā)光波數(shù)之差為一恒定值（頻率差），這一波數(shù)（頻率差）稱(chēng)為拉曼位移。不同溶劑的拉曼位移不同，相同溶劑，激發(fā)波長(zhǎng)不同，拉曼峰位不同。水拉曼位移0.338|n-i,當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為248nm時(shí)，拉曼峰位=248/（l-0.338*248/1000）=270.7nmo拉曼散射峰可通過(guò)計(jì)算初步判定，改變激發(fā)光波長(zhǎng),拉曼峰隨之移動(dòng)，熒光峰不動(dòng)。五、溶劑影響熒光物質(zhì)在不同溶劑中，其電離程度、分子存在形式、氫鍵結(jié)合程度、分子締合形式及締合程度不同，使熒光物質(zhì)的熒光效率、內(nèi)濾光效應(yīng)、熒光淬滅程度不同。例如，苯胺蔡磺酸類(lèi)化合物，在水溶液中基本無(wú)熒光，在醇類(lèi)溶液中呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。而且，隨醇溶劑的極性減小，熒光增強(qiáng)，峰位藍(lán)移。

六、 pH影響溶液pH主要影響熒光物質(zhì)分子的電離程度、絡(luò)合、螯合形式，從而影響熒光分子結(jié)構(gòu)和離子效率。七、 溫度影響III溶液溫度升高，分子內(nèi)部能量變化，分子碰撞加劇,無(wú)輻射躍遷幾率增加。一般情況下，大多數(shù)熒光物質(zhì)，溫度升高1°C,熒光強(qiáng)度降低1?2%。一些生物樣品，溫度升高1°C,熒光強(qiáng)度降低10%。在低溫下，大多數(shù)應(yīng)光物質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度增加。III八、其他干擾除以上主要干擾外，試劑雜質(zhì)可能引起熒光污染。樣品池、橡膠塞、潤(rùn)滑油、濾紙以及樣品中微生物滋生均可能引起應(yīng)熒光污染，樣品處理過(guò)程中交叉污染也應(yīng)防止。第_早第一節(jié)

第二節(jié)熒光分光光度計(jì)儀器結(jié)構(gòu)熒光分光光度計(jì)主要部件第一節(jié)儀器結(jié)構(gòu)熒光分析儀器種類(lèi)較多，有目測(cè)熒光計(jì)、光電熒光計(jì)、熒光分光光度計(jì)等。熒光分光光度計(jì)光路結(jié)構(gòu)如下第二節(jié)熒光分光光度計(jì)主要部件第二節(jié)熒光分光光度計(jì)主要部件一、 光源二、 單色器三、 樣品池檢測(cè)器五、數(shù)據(jù)記錄與處理裝置一、光源熒光分光光度計(jì)要求光源發(fā)射強(qiáng)度大，穩(wěn)定、光譜連續(xù)、光強(qiáng)隨必成變化小，常用的有高壓汞燈、低壓汞1-1連續(xù)、光強(qiáng)隨必成變化小，常用的有高壓汞燈、低壓汞1-1燈、氤燈。汞燈輻射強(qiáng)度大、穩(wěn)定，供電電源簡(jiǎn)單。但是，光譜不是連續(xù)光譜。氤燈在紫外和可見(jiàn)光區(qū)能給出較好的連續(xù)光譜，輻射強(qiáng)度大，在300?400nm輻射強(qiáng)度平穩(wěn)，在300nm以下輻射強(qiáng)度減小。供電要求嚴(yán)格，點(diǎn)燈要求瞬時(shí)高壓，能產(chǎn)生臭氧。目前，有脈沖供電光源。二單色器單色器包括激發(fā)單色器和發(fā)射單色器，單色器的主要部件為光柵，主要釆用閃耀光柵，集光效率高，70?90%能量集中在一級(jí)光譜中。棱鏡、濾光片僅用于低檔儀器。三、樣品池樣品池采用無(wú)熒光、方形石英比色皿。特殊需要的檢測(cè)，可采用30°、45°角形比色皿。檢測(cè)器檢測(cè)器主要采用光電倍增管，檢測(cè)器工作負(fù)高壓可調(diào)，以提高檢測(cè)靈敏度。五、數(shù)據(jù)記錄與處理裝置目前，熒光分光光度計(jì)主要釆用計(jì)算機(jī)釆集