煙草組織培養(yǎng)實驗方案摘要本實驗通過配制四種培養(yǎng)基來實現(xiàn)煙草種子萌發(fā)，種子苗葉片誘導(dǎo)、分化及植株再生，從而獲得課題所需要的基因受體植株。關(guān)鍵詞煙草組織培養(yǎng)前言組織培養(yǎng)不僅是一種植物快速繁殖的手段,同時也是植物改良、種質(zhì)保存和次生物質(zhì)生產(chǎn)的理想途徑。煙草是典型的基因工程模式植物,易于進行組織培養(yǎng),容易得到再生的轉(zhuǎn)化植株。一實驗植物：華煙6號二實驗材料：華煙6號種子三實驗方法與步驟1．培養(yǎng)基的配制本次實驗使用（1）種子萌發(fā)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+GA30.7mg/L；（2）愈傷組織誘導(dǎo)及其幼芽分化培養(yǎng)基:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA1.0mg/L；（3）幼芽增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L（4）生根培養(yǎng)基：MS+NAA0.2mg/L。上述培養(yǎng)基均附加3%蔗糖，0.8%瓊脂，pH5.8,培養(yǎng)溫度25±2°C,光照強度2000lx。培養(yǎng)基的滅菌——高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌法）無菌苗的獲得把煙草種子用市售絲襪（或紗布）包好，先分別用75%乙醇或無菌水浸泡30s，用無菌水洗凈表面抑制種子萌發(fā)的藥物，待洗滌的水清澈透明，然后將煙草種子用70%酒精浸泡1min,10%NaC10消毒10min,經(jīng)無菌水漂洗后，在超凈工作臺處（紫外滅菌20?30min）接種于以配置好的（1）培養(yǎng)基，放入（27±1）C的光照培養(yǎng)架中培養(yǎng)。光照周期為10h（8:00?18:00）光照,12h暗培養(yǎng)。種子苗具4~5葉時繼代擴繁備用。煙草葉片愈傷誘導(dǎo)及不定芽分化在超凈工作臺上取上述煙草無菌苗幼嫩葉片1?2片于無菌培養(yǎng)皿中，將葉片切成1.0?1.5平方厘米的小方塊，接入（2）中培養(yǎng)。約2?3d后，葉片外植體卷曲、增厚、膨脹，15d后外植體脫分化形成疏松絮狀淺黃綠色的愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%。30d后，從葉片外植體產(chǎn)生的疏松愈傷組織上分化出許多淺黃綠色芽點。60d后，不僅從愈傷組織上分化出越來越多幼芽，芽誘導(dǎo)頻率（芽數(shù)/塊愈傷組織）為25?35，而且還可觀察到，該愈傷組織較早分化產(chǎn)生的幼芽葉片呈現(xiàn)不同程度白化（或缺綠）。但此時若將此缺綠幼芽切下，轉(zhuǎn)接至不加2,4-D的幼芽增殖培養(yǎng)基（3）上，3?5d后即可恢復(fù)正常，缺綠癥狀消失，并可不斷增殖，發(fā)育成綠色健壯的小苗。光照時間8?12小時，溫度通常在23?28C之間。誘導(dǎo)生根及移栽取約3?4cm長的無根小苗接種于生根培養(yǎng)基（4）中，約7?8d后，幾乎所有外植體均從其基部產(chǎn)生白色幼根，根誘導(dǎo)頻率為3?5，部分在培養(yǎng)基表面的根具大量白色根毛。當試管苗長至5?6cm高時，打開瓶口，在散射光下放置2d后取出，洗去根部殘留培養(yǎng)基，種植于經(jīng)過消毒的珍珠巖、泥炭土和菜園土等量混合的基質(zhì)中，成活率可達95%以上。四數(shù)據(jù)記錄：煙草種子的萌發(fā)情況編號種子數(shù)目萌發(fā)時間萌發(fā)數(shù)目萌發(fā)時間染菌率編號煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)情況每瓶接種數(shù)愈傷組織誘導(dǎo)率愈傷組織狀態(tài)染菌率編號分化率煙草葉片愈傷組織再生植株情況編號種子數(shù)目萌發(fā)時間萌發(fā)數(shù)目萌發(fā)時間染菌率編號煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)情況每瓶接種數(shù)愈傷組織誘導(dǎo)率愈傷組織狀態(tài)染菌率編號分化率煙草葉片愈傷組織再生植株情況每個愈傷組織分化芽數(shù)分化情況染菌率煙草葉片誘導(dǎo)生根情況編號生根率生根情況再生植株分化根數(shù)染菌率參考文獻1、肖楊、陳雁、董華林.影響煙草種子萌發(fā)的理化因素研究,安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2008,36（34）:14871-148722、李澤民編譯.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1992.53、曹孜義，劉國民?實用植物組織培養(yǎng)教程[M].蘭州:甘肅科學(xué)技術(shù)出版社,1996.4、施和平,黃群聲.煙草葉片組織培養(yǎng)及植株再生（簡報）,亞熱帶植物科學(xué).2003,32（4）:63.5、潘戰(zhàn)生，陳暨耀，蔡懷新，張丕方，宋慶梅，煙草葉組織培養(yǎng)中光與激素對形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)作用，實驗生物學(xué)報，1989，22（3）：279~2856、王荔，楊艷瓊，楊德，李本遜，不同激素濃度及培養(yǎng)基對煙草愈傷組織分化的影響，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，14（4）：371~3757、許智宏，王熊，劉桂云，煙草葉組織培養(yǎng)中器官形成的研究，植物生理學(xué)報，1978，4：176~182.8、劉滌，遲靜芳，劉佳蕓，煙草愈傷組織器官發(fā)生過程中的