定量PCR反應(yīng)體系

①actin③achi⑤aly⑦vlg⑨stat②actin④achi⑥aly⑧vlg⑩stat模板cDNA4ulTagmixture10ul引物10.5ul引物20.5ulH205ul1♀模板2♂模板①③⑤⑦⑨443.45ng/ul686.75ng/ul②④⑥⑧⑩17.738ng/ul26.47ng/ul第1頁/共22頁第一頁，共23頁。定量與常規(guī)PCR的差別常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析定量PCR技術(shù)：通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析三個(gè)關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)，定量，熒光第2頁/共22頁第二頁，共23頁。PCR分四個(gè)階段第3頁/共22頁第三頁，共23頁。如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。第4頁/共22頁第四頁，共23頁。定量原理

確定初始模板的濃度初始DNA量越多,熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量第5頁/共22頁第五頁，共23頁。第6頁/共22頁第六頁，共23頁。起點(diǎn)定量與終點(diǎn)定量第7頁/共22頁第七頁，共23頁。熒光化學(xué)SYBRGreen1

TaqMan第8頁/共22頁第八頁，共23頁。TaqMan第9頁/共22頁第九頁，共23頁。SYBRGreenI工作原理

。SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未結(jié)合SYBRGreen1dye變性:無熒光信號第10頁/共22頁第十頁，共23頁。SYBRGreenI應(yīng)用范圍起始模板濃度定量融解曲線分析---可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和（或）引物二聚體基因型分析第11頁/共22頁第十一頁，共23頁。SYBRGreenI優(yōu)點(diǎn)SYBRGreenI缺點(diǎn)第12頁/共22頁第十二頁，共23頁。第13頁/共22頁第十三頁，共23頁。PCR程序指南第14頁/共22頁第十四頁，共23頁。UNG酶使用原理第15頁/共22頁第十五頁，共23頁。金牌Tag酶活性第16頁/共22頁第十六頁，共23頁。參比熒光：管家熒光ROX第17頁/共22頁第十七頁，共23頁。ROX校正效果第18頁/共22頁第十八頁，共23頁。96孔板設(shè)置舉例第19頁/共22頁第十九頁，共23頁。PCR曲線第20頁/共22頁第二十頁，共23頁。標(biāo)準(zhǔn)曲線第21頁/共22頁第二十一頁，共23頁。感謝您的觀看！第22頁/共22頁第二十二頁，共23頁。內(nèi)容總結(jié)定量PCR反應(yīng)體系。②④⑥⑧⑩。通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。實(shí)時(shí)，定量，熒光。Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。初始DNA量越多,熒光