Tiam1在肝癌細(xì)胞抗失巢凋亡中的作用及機(jī)制研究研究現(xiàn)狀研究思路實(shí)驗(yàn)方案創(chuàng)新意義實(shí)踐可行概要12345肝癌是常見的惡性腫瘤之一，研究肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的防治將成為21世紀(jì)肝癌研究的一大熱點(diǎn),也是攻克肝癌的難關(guān)之一一、肝癌國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀切除后5年復(fù)發(fā)率為51.1%-61.5%局部浸潤(rùn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率低SurvivalratesforlivercancerStage5-yearRelativeSurvivalRateLocalized28%Regional7%Distant2%失巢凋亡(Anoikis)細(xì)胞程序性死亡由細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)或鄰近細(xì)胞脫離接觸而誘發(fā)的抗失巢凋亡為腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的先決條件?。?！腫瘤轉(zhuǎn)移抗失巢凋亡的機(jī)制細(xì)胞改變整合蛋白的表達(dá)模式細(xì)胞自分泌生長(zhǎng)因子或由鄰近細(xì)胞旁分泌ROS不依賴配體激活生長(zhǎng)因子受體組成性激活細(xì)胞促存活的信號(hào)通路Tiam1

（Ｔ淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子１）鼠Ｔ淋巴瘤中克隆出來的基因多種惡性腫瘤組織中呈陽性表達(dá)并與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。肝癌肺癌胃癌乳腺癌皮膚癌鼻咽癌結(jié)直腸癌、mRNA的相對(duì)表達(dá)量：癌組織>癌旁組織；肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移組>非轉(zhuǎn)移組表達(dá)強(qiáng)度與肺癌的組織學(xué)類型、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)Tiam1基因敲除小鼠腫瘤發(fā)生率明顯減少，腫瘤發(fā)展緩慢Tiam1的表達(dá)與腫瘤分化程度和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)Tiam1蛋白表達(dá)陽性率：肝細(xì)胞癌組織>癌旁肝組織；肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移組>非轉(zhuǎn)移組Tiam1影響抗細(xì)胞失巢凋亡可能的三條途徑Tiam1FAKAP-1BimBcl2Rac-1Rac-1GTPRac1-ROCK1/PAK1-LIMK1-ADF/cofilin抗失巢凋亡p53ERKPI-3K/AKT探討Tiam1在肝癌細(xì)胞抗失巢凋亡機(jī)制中的作用?二、研究思路肝癌細(xì)胞系培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)各組細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色MTT技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)Transwell小室遷移

WesternBlot檢測(cè)可能通路的關(guān)鍵蛋白數(shù)據(jù)分析在體實(shí)驗(yàn)臨床樣本免疫組化分析Tiam1表達(dá)的檢測(cè)低表達(dá)Tiam1對(duì)照組對(duì)照組過表達(dá)Tiam1LO2細(xì)胞系（正常細(xì)胞系）HepG2細(xì)胞系（低侵襲性肝癌細(xì)胞系）低表達(dá)Tiam1對(duì)照組SMCC7721細(xì)胞系(高侵襲性肝癌細(xì)胞系）過表達(dá)Tiam1三、實(shí)驗(yàn)方案：細(xì)胞培養(yǎng)及檢測(cè)篩選:培養(yǎng)符合要求的肝癌細(xì)胞系，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Tiam1表達(dá)程度對(duì)LO2細(xì)胞系，進(jìn)行過表達(dá)Tiam1基因的操作對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)Tiam1基因的操作和敲除Tiam1基因的操作SMCC7721細(xì)胞系，進(jìn)行敲除Tiam1基因的操作肝癌細(xì)胞系的抵抗失巢凋亡能力檢測(cè)：懸浮培養(yǎng)各組細(xì)胞，再利用

臺(tái)盼藍(lán)染色、MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室遷移檢測(cè)關(guān)鍵蛋白可能通路的標(biāo)志性蛋白或因子檢測(cè)1）ERK途徑：ERK、p-ERK、MEK、p-MEK2）PI-3K途徑：PI-3K、p-Akt473、p-GSK3b、Bcl-23）Rac1途徑：Rac1-GTP數(shù)據(jù)處理

利用SAS生物統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析四、創(chuàng)新性及研究意義1.首次研究Tiam1對(duì)肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡的影響,有助于進(jìn)一步揭示Tiam1影響肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制；2.為判斷肝癌的分期以及診斷肝癌轉(zhuǎn)移提供新的標(biāo)準(zhǔn)；3.為防治腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點(diǎn)。Tiam1的表達(dá)細(xì)胞抗失巢凋亡的信號(hào)通路腫瘤轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)密切相關(guān)？技術(shù)材料指導(dǎo)老師經(jīng)費(fèi)實(shí)驗(yàn)所涉及的技術(shù)均為實(shí)驗(yàn)室常見，同學(xué)們有一定的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)，并熱心科研儀器設(shè)備以及大部分試劑由王海河教授實(shí)驗(yàn)室提供，少數(shù)另需實(shí)驗(yàn)材料不難訂購(gòu)?fù)鹾：咏淌谠谀[瘤遷移等方面的研究具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，能很好地指導(dǎo)我們解決實(shí)驗(yàn)遇到的困難。預(yù)算在所提供的資金范圍之內(nèi)。五、可行性分析Thankyou2014.12.28細(xì)胞體外培養(yǎng)（1）準(zhǔn)備工作（2）取材在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞經(jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器皿中。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時(shí)，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。

（3）培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)。正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀察一次。（4）凍存及復(fù)蘇凍存的溫度一般用液氮的溫度—－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。（1）Tiam1過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建通過NCBI查詢Tiam的mRNA序列，設(shè)計(jì)引物構(gòu)建CDS序列引物，并引入酶切位點(diǎn)BamHI和HindIII，將Tiam片段構(gòu)建入pEGFP-C1表達(dá)載體內(nèi)，Tiam引物序列如下：Tiam1F1：AAGCTTCGGCGTGATAAGCACAGAATiam1R1：GGATCCGGAGACGGCATCAGAATCAA然后通過PCR擴(kuò)增，分離回收后構(gòu)建到pEGFP-C1表達(dá)載體測(cè)序鑒定.（2）Tiam1siRNA質(zhì)粒構(gòu)建靶向Tiam1的siRNA序列如下：Tiam1_1(T1)：GGCGAGCUUUAAGAAGAAATT(正義鏈)；UUUCUUCUUAAAGCUCGCCGT(反義鏈)；Tiam1_5(T5)：CAUGUAGAGCACGAGUUUUTT(正義鏈)；AAAACUCGUGCUCUACAUGTT(反義鏈)；Tiam1_6(T6)：GGUUCUGUCUGCCCAAUAATT(正義鏈)；UUAUUGGGCAGACAGAACCAG(反義鏈)按說明書將上述siRNA序列構(gòu)建到pUTSV1載體內(nèi)，經(jīng)E.coliDH5A克隆,提取并純化,得到的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。（3)構(gòu)建穩(wěn)定的Tiam過表達(dá)和敲低細(xì)胞系根據(jù)說明書要求,選用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將Tiam過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LO2細(xì)胞，siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2、SMCC7721細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)藥物篩選2~3周后得到穩(wěn)定細(xì)胞株?；蚯贸?）基因載體的構(gòu)建把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上（2）目的基因?qū)雽⒒虼虬休d體通過一定的方式(常用電穿孔法)導(dǎo)入細(xì)胞中，使外源DNA與細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將打靶載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中從而得以表達(dá)。（3）用選擇性培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞一般地，篩選使用正、負(fù)選擇法，比如用G418篩選所有能表達(dá)neo基因的細(xì)胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表達(dá)的細(xì)胞，剩下的細(xì)胞為命中的細(xì)胞。（4）檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物。臺(tái)盼藍(lán)染色技術(shù)1）.用Hanks液配制0.1%臺(tái)盼藍(lán)溶液；2）.用0.5%胰蛋白酶：0.2%EDTA=1：1混合液來消化培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞；3）.再加入適量Hanks液制成細(xì)胞懸液；4）.將待染色細(xì)胞稀釋至所需濃度（方法及濃度范圍與細(xì)胞計(jì)數(shù)相同）；5）.每0.1ml細(xì)胞懸液約加新鮮配制的染液一小滴，室溫下染3—5min；6）.染色過的細(xì)胞材料，取一滴細(xì)胞懸液置玻片上，加蓋玻片后放高倍鏡下觀察；7）.死亡的細(xì)胞著淺藍(lán)色并膨大，無光澤?；罴?xì)胞不著色并保持正常形態(tài)，有光澤；8）.計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)目；9）.統(tǒng)計(jì)未染色細(xì)胞?？砂垂接?jì)算出細(xì)胞活率。細(xì)胞活率（%）=未染色的細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù)×100（1）配置方法：

通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包?。?）實(shí)驗(yàn)步驟：1）懸浮細(xì)胞①、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)?/p>

①補(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul；

②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋lg/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；

③需檢測(cè)物10ul；

④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100(儲(chǔ)存液1001640）。②、置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。③、每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）④、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔，每組設(shè)定3復(fù)孔。MTT法流式細(xì)胞儀①打開電源，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱；②打開氣體閾，調(diào)節(jié)壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)；③在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；④利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0和90散射的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，并要求變異系數(shù)為最?。虎葸x定流速、測(cè)量細(xì)胞數(shù)、測(cè)量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測(cè)量樣品和對(duì)照樣品；同時(shí)選擇計(jì)算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測(cè)量進(jìn)程；⑥樣品測(cè)量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；⑦因?yàn)閷?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已存入計(jì)算機(jī)硬盤（有的機(jī)器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大），因此可關(guān)閉氣體、測(cè)量裝置，而單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；⑧將所需結(jié)果打印出來。Transwell細(xì)胞遷移率試驗(yàn)1.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞,0125%胰酶消化后懸浮于培養(yǎng)基↓2.將Tran-swell小室置入24孔板孔內(nèi)形成上下兩室,下室加入600Ll含10%小牛血清的培養(yǎng)基,上室加入100Ll細(xì)胞懸液(3X105細(xì)胞),↓3.將上室含部分未粘附細(xì)胞的培養(yǎng)基吸出保存于250Ll離心管↓3.小室用PBS漂洗2次后，置入另一加有100Ll0125%胰酶的24孔板小孔,消化約3~5min,↓5.下室加入200Ll培養(yǎng)基,用移液器吹打小室膜下表面,將遷移細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基↓6.將此細(xì)胞懸液加入至一新的未涂布FN的Transwell小室的上室;同時(shí)將原先吸出的上室含未粘附細(xì)胞的培養(yǎng)基加回遷移實(shí)驗(yàn)用小室的上室;↓7.小室再次置入加有600Ll含10LMlTT(5mg/ml)的24孔板小孔內(nèi),孵育4h后取出小室，緊貼濾紙吸干培養(yǎng)基↓8.每小室上室加入100LlDMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚,最后將溶解液移入96孔板,酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值,分別獲得未遷移細(xì)胞和遷移細(xì)胞的OD值?！?.遷移率(%)=ODmig/(ODmig+ODnon)X100，其中ODmig為遷移細(xì)胞的OD值,ODnon為遷移細(xì)胞的OD值?！?0.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)步驟①滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。②滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間（參考：30min）。③取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5min，不時(shí)振蕩。④取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。⑤立即用熒光顯微鏡觀察。觀