§5.1DNA的粗提取與鑒定一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）提取DNA的方法1.提取生物大分子的基本思路

選用一定的物理或化學(xué)方法，分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2.提取DNA的基本思路提取DNA，去除其他成分利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異⑴DNA的溶解性DNA和蛋白質(zhì)等成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀；或者讓其他成分溶解，DNA析出。3.DNA等大分子的理化性質(zhì)⑵DNA不溶于酒精溶液DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。⑶DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性①蛋白酶——水解蛋白質(zhì)，對(duì)DNA沒(méi)有影響②高溫——大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃

而DNA在80℃以上才會(huì)變性③洗滌劑——溶解細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)

但對(duì)DNA沒(méi)有影響（二）DNA的鑒定沸水浴條件下，DNA遇二苯胺被染成藍(lán)色。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取從下列材料中選取2～3種原則：菜花、香蕉、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜；魚(yú)卵、豬肝、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌凡是含有DNA的生物材料都可以考慮選用DNA含量相對(duì)較高的組織要容易取得、細(xì)胞分散或容易分散、細(xì)胞容易破碎或容易研碎、細(xì)胞核中的DNA容易釋放。（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液1、動(dòng)物細(xì)胞——容易破碎雞血細(xì)胞溶液：加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液。蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分大量進(jìn)入血細(xì)胞，使血細(xì)胞脹裂；加上攪拌作用，加速雞血細(xì)胞細(xì)胞膜、核膜破裂，從而釋放出DNA。2、植物細(xì)胞——需要溶解細(xì)胞膜①加入一定的洗滌劑和食鹽②充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液洗滌劑——離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，利于DNA釋放食鹽——NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中。研磨不充分，核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量少，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理。討論：濾液/研磨液中可能含有哪些成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)1.DNA的溶解性2.DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性（三）除去濾液中的雜質(zhì)利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；利用DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，使蛋白質(zhì)變性與DNA分離。為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？（四）DNA的析出與鑒定與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)95％)，靜置2－3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物。

——粗提取DNA1、DNA的析出用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，（以利于DNA分子的附著和纏繞）卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水。2.DNA的鑒定⑴向兩支試管中分別加入2mol/LNaCl

溶液5ml⑵其中一支試管中加入DNA絲狀物⑶各加入二苯胺試劑4ml⑷混勻后，置于沸水浴中加熱5min⑸待冷卻后，比較兩只試管中溶液的顏色變化觀察現(xiàn)象：溶解絲狀物的溶液變?yōu)樗{(lán)色觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備1、請(qǐng)解釋提取DNA的實(shí)驗(yàn)操作中主要的步驟的目的。（1）材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；（2）DNA的釋放和溶解，是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；（3）DNA的純化，根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開(kāi)；（4）對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。共有“三次過(guò)濾，兩次析出，七次攪拌”加入“兩次蒸餾水，三次NaCl溶液，一次酒精”方法步驟加入物質(zhì)實(shí)驗(yàn)原理及現(xiàn)象1.制備雞血細(xì)胞液檸檬酸鈉溶液防止血液凝固2.提取雞血細(xì)胞細(xì)胞核物質(zhì)蒸餾水使血細(xì)胞過(guò)度吸水而破裂3.溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA2m1／L的NaCI溶液DNA在高濃度NaCI溶液中溶解度大4.析出含DNA的黏稠物蒸餾水將NaCl溶液稀釋至0.14mol/L，使得DNA最大限度地釋出5.濾取含DNA的黏稠物使含DNA的黏稠物留在紗布上6.將DNA的黏稠物再溶解2mol／L的NaCl溶液同37.過(guò)濾含DNA的NaCl溶液除去含DNA的濾液中的雜質(zhì)8.提取含有雜質(zhì)較少的DNA冷卻的95％的酒精50mLDNA不溶于酒精，出現(xiàn)沉淀9.DNA的鑒定(1)向兩支試管中各加入2mol／L的NaCl溶液5mL(2)將絲狀物放入A試管中，攪拌使其溶解(3)向兩支試管中各加入4mL二苯胺試劑。混合均勻后沸水浴5minA出現(xiàn)藍(lán)色，B無(wú)變化2、你認(rèn)為從細(xì)胞中提取某種特定的蛋白質(zhì)與提取DNA一樣容易嗎？提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。（1）與DNA相比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；（2）并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒(méi)有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、基本單位3、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖（二）DNA的復(fù)制2、時(shí)期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場(chǎng)所細(xì)胞核（主）、線粒體、葉綠體4、模板DNA母鏈1、概念由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的DNA的過(guò)程5、原材料脫氧核苷酸6、基本條件酶、ATP、原料、模板7、復(fù)制過(guò)程（半保留復(fù)制）邊解旋邊復(fù)制8、遵循原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則9、復(fù)制的意義使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性。（三）PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）1、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物2、DNA聚合酶作用過(guò)程當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸3、PCR原理①在80－100°C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)。②當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸靶序列靶序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)拷貝的靶序列利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因二、PCR的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次一、基礎(chǔ)知識(shí)蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù):(蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì))形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別。提取分離方法凝膠色譜法凝膠電泳法血紅蛋白的提取與分離1.凝膠色譜法

（1）原理：大分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；小分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。（2）材料:多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。（3）分離過(guò)程混合物上柱洗脫大分子流動(dòng)快小分子流動(dòng)慢收集大分子收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等（4）緩沖溶液－－洗脫劑組成：配制：作用：調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對(duì)溶液pH的干擾而保持

pH穩(wěn)定。2．凝膠電泳法：1）原理：不同蛋白質(zhì)微粒帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)（或介質(zhì)）中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。思考：蛋白質(zhì)為什么帶有電荷？在一定的PH下，蛋白質(zhì)可電離的基團(tuán)會(huì)帶上電荷

決定運(yùn)動(dòng)方向電場(chǎng)作用力介質(zhì)中形成阻力決定運(yùn)動(dòng)速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√2）蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)作用下運(yùn)動(dòng)的影響因素3）方法:a.瓊脂糖凝膠電泳（如PCR產(chǎn)物的檢測(cè)）

b.聚丙酰胺凝膠電泳（測(cè)蛋白質(zhì)分子量的方法）

c.聚苯乙烯凝膠電泳如：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。

二、實(shí)驗(yàn)操作樣品處理和粗分離純化純度鑒定

血液組成成分1.洗滌紅細(xì)胞2.釋放血紅蛋白3.分離血紅蛋白4.透析血紅蛋白血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞中含量最高的化合物是_____________。血紅蛋白是由___________和____________構(gòu)成的（4條肽鏈），每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)能與O2和CO2結(jié)合的______________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素1.

紅細(xì)胞洗滌血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒(méi)有黃色目的：洗去血漿蛋白濾紙過(guò)濾脂類物質(zhì)3.分離血紅蛋白紅細(xì)胞混合液高速離心10min離心管燒杯有機(jī)溶劑血紅蛋白2.釋放血紅蛋白操作目的分析：蒸餾水的作用是________________________。加入甲苯的作用是______________________。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀_____________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅