畢赤酵母表達(dá)實驗手冊大腸桿菌表達(dá)統(tǒng)最突出的優(yōu)點是藝簡單、產(chǎn)量高、產(chǎn)成本低。然而，多蛋白質(zhì)在翻后，需經(jīng)過翻譯后修飾加工，如磷酸、糖基化、酰胺化蛋白酶水解等過程才轉(zhuǎn)化成活性形式。腸桿菌缺少上述加機(jī)制，不適合用于達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)另外，蛋白質(zhì)的活還依賴于形成正確二硫鍵并折疊成高結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)往往不能進(jìn)行正確的折疊，是以包含體狀態(tài)存在。包含體的形成雖然簡化了產(chǎn)物的純化，但不利于產(chǎn)物的活性，為了得到有活性的蛋白，就需要進(jìn)變性溶解及復(fù)性等作，這一過程比較瑣，同時增加了成。與大腸桿菌相比，母是低等真核生物具有細(xì)胞生長快，于培養(yǎng)，遺傳操作單等原核生物的特點又具有真核生物時達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正加工，修飾，合理空間折疊等功能，非有利于真核基因的達(dá)，能有效克服大桿菌系統(tǒng)缺乏蛋白澤后加工、修飾的不。因此酵母表達(dá)系受到越來越多的重和利用。大腸桿菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)前已商業(yè)化的基因工程產(chǎn)品大多是通過大腸桿菌表達(dá)的，其主要優(yōu)點是成本低、產(chǎn)量高、易于操作。但大腸桿菌是原核生物，不具有真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力，其產(chǎn)物往住形成沒有活性的包涵體，需要經(jīng)過變性、復(fù)性等處理，才能應(yīng)用。近年來，以酵母作為工程菌表達(dá)外源蛋白日益引起重視，主更是因為酵母是單細(xì)胞真核生物，不但具有大腸桿菌易操作、繁殖快、易于工業(yè)化生產(chǎn)的特點，還具有真核生物表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)調(diào)控和蛋白修飾功能，避免了產(chǎn)物活性低，包涵體變性、復(fù)性等等間題［］。與大腸桿菌相比，酵母是單細(xì)胞真核生物，具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，人們對釀酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae分子遺傳學(xué)方面的認(rèn)識最早，釀酒酵母也最先作為外源基因表達(dá)的酵母宿主．1981年釀酒酵母表達(dá)第一個外源基因一擾素基因，隨后又一系列外源基因在系統(tǒng)得到表達(dá)。雖然擾素和胰島素已大生產(chǎn)并在人群中廣應(yīng)用，但很大部分達(dá)由實驗室擴(kuò)展到工業(yè)規(guī)模時，培養(yǎng)基中維特質(zhì)粒高拷貝數(shù)的選擇壓力消失，質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降，而大多數(shù)外源基因的高效表達(dá)需要高拷貝數(shù)的維特，因此引起產(chǎn)量下降。同時，實驗室用培養(yǎng)基復(fù)雜而昂貴，采用工業(yè)規(guī)模能夠接受的培養(yǎng)基時，往往導(dǎo)致產(chǎn)量的下降。為克服釀酒酵母的局限，人們發(fā)展了以

甲基營養(yǎng)型酵母（methylotrophicyeast為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)［

2］甲基營養(yǎng)型酵母包括：、Candida等．以Pichia.pastoris（畢赤斯德酵母）為宿主的外源因表達(dá)系統(tǒng)近年來展最為迅速，應(yīng)用最為廣泛，已利用系統(tǒng)表達(dá)了一系列有要生物學(xué)活性的蛋質(zhì)。畢赤酵母系統(tǒng)廣泛應(yīng)用，原因在該系統(tǒng)除了具有一般酵母所具有的特點外，還有以下幾個優(yōu)點［

1、］；⑴有醇氧化酶

AOX1基啟動子，這是目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動子之一

。表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合。（即同源重組）菌株易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高。⑷畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細(xì)胞的毒害作用。Pichia.pastoris

基因表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，具有易于高密度發(fā)酵，表達(dá)基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌并適糖基化，培養(yǎng)方便濟(jì)等特點。利用強(qiáng)可調(diào)控啟動子

AOX1，高效表達(dá)了HBsAg、TNFEGF破傷風(fēng)毒素C片段、因工程抗體等多種源基因，證實該系統(tǒng)為高效、實用、簡便，以提高表達(dá)量并保持產(chǎn)物生物學(xué)活性為突出特征的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，而且非常適宜子擴(kuò)大為工業(yè)規(guī)模4FDA價來自該系統(tǒng)的基因工程產(chǎn)品，最近來自該系統(tǒng)的

Cephelon制劑已獲得批準(zhǔn)，所以該系統(tǒng)被認(rèn)為是安全的．Pichia.pastoris

表達(dá)系統(tǒng)在生工程領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來越重要的作用，促進(jìn)更多外源基因在該系統(tǒng)的高效表達(dá)，提供更為廣泛的基因工程產(chǎn)品［。近年來，Invitrogon公司開了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品，

短短幾年已經(jīng)有多種外源蛋自在該系得到有效表達(dá)，被認(rèn)為是目前最有效的酵母表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4養(yǎng)缺陷標(biāo)記其中，GS115茵株具有AOX1基因，是＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點被ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。Pichia.pastoris酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實現(xiàn)外源基因的表達(dá)［5．包括啟動子、外源基因克隆位點、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌復(fù)制擴(kuò)增，然后被導(dǎo)入宿主酵母細(xì)胞。為使產(chǎn)物分泌胞外，表達(dá)載體還需帶有信號肽序列。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有多種分泌型表達(dá)質(zhì)粒，有許多蛋白在畢赤酵母得到了高效分泌表達(dá)。胞外表達(dá)需要在外源蛋白的N末加上一段信號肽序列，引導(dǎo)重組蛋白進(jìn)入分泌途徑，可使蛋白蛋白質(zhì)在分泌到胞外之后獲得準(zhǔn)確的構(gòu)型。畢赤酵母對外源蛋白自身的信號序列識別能力差，在本試驗中所使用α質(zhì)，其信號肽來自釀酒酵母的交配因子（α），能很好的達(dá)到以上的要求。并且作為新一代的畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒，它還擁有一個特點是其具有

Zeocin抗標(biāo)記基因，給我們篩選轉(zhuǎn)化子的工作帶來很大的便利［

12。pPICZA質(zhì)粒是作為新一代的畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒，它的主特點簡如下：⑴有強(qiáng)效可調(diào)控啟動子

AOX1（alcohol，醇氧化）；⑵有抗性選標(biāo)記基因，重組轉(zhuǎn)化子可直接用

Zeocin進(jìn)行篩選，即在YPDZ平板上生長的轉(zhuǎn)化子中％都有外基因的合，大大簡化了重組轉(zhuǎn)化酵母的篩選過程［。在操作過程中，可用來篩選含表達(dá)載體αA的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，不必另外使用Amp經(jīng)濟(jì)而又簡便；。在表達(dá)載體A0X15’端啟動子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位點，多克隆位點下游有A0X13’端止序列；分泌效率強(qiáng)的信號肽α-factor.Invitrogen

公司開發(fā)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品作為目前被應(yīng)用為最為廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)，其主要的優(yōu)點有：醇氧化酶可調(diào)控的強(qiáng)啟動子，能高密度發(fā)酵，重組蛋白表達(dá)量高。外源基因整合在酵母基因組上，可以穩(wěn)定存在。同時，高效分泌表達(dá)質(zhì)粒能將外源蛋白表達(dá)后，進(jìn)行翻譯后加工處理，將外源蛋白分泌到細(xì)胞外，不但提高表達(dá)蛋白的活性，而且，有利于產(chǎn)物的純化。一．畢赤酵母表達(dá)常用溶液及緩沖液的配制11種母液的配制10*YNB

（含有硫酸銨、無氨基酸的

13.4%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基）4℃保存34g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基（無硫酸銨）

+100g硫酸銨，溶于

水，過濾除菌。500*B（0.02%生物素4℃保保存期1。20mg的生物素溶于100ml水中，過濾除菌。100*H（0.4%Histidine組氨酸）4℃保存保存期1年。400mg的組氨酸溶于100ml水中，（加熱至℃以促進(jìn)溶解），過濾除菌。10*D

（20%Dextrose葡萄糖）

1200g1000ml中，滅菌15min過濾除菌。10*M

（5%Methanol

甲醇）

25ml95ml勻，過濾除菌。10*GY

（10%Glycerol

甘油）保存為1年以上。100ml甘油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。100*AA

（0.5%ofeachAminoAcid，各種氨基酸）

4保存保存期為1年。分別將500mg的谷氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、亮氨酸和異亮氨酸溶于100ml水中，過濾除菌。1M磷酸鉀溶液（potassiumphosphatebuffer

），1mol/L的K2HPO4

液132ml與的液868ml混勻，為，需調(diào)節(jié)，使用磷酸和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH1.2常用溶液緩沖夜1.2.1堿裂解法抽提質(zhì)粒所溶液Ⅰ：50mmol/Lglucose100mmol/LEDTA25mmol/L－HCI(pH8.0)溶液Ⅱ：LNaOH，SDS臨用時配制）溶液Ⅲ：29.44gKAc11.5mlAceticacid4保存。1.2.210%甘油（Glycerol）：

ddH2O100ml。將100ml甘油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。保存期為1.2.3Rnase-H2O：1ulRnasedd。℃保存。

1年以上1.2.4

緩沖液：10mmol/Tris-CI（pH80，lmmol/LEDTA（8.0）1.2.5STE

緩沖液：0.1mol//LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)1.2.6SCE

緩沖液：1mol/LSorbitol(山梨醇),10mmol/L檸檬酸鈉，/LEDTA1.2.7potassiumphosphatebuffer132ml1MK2HPO4868ml1MKH2PO4

（pH6.0）：1.2.850XTAE

瓊脂糖凝膠電泳緩沖液，pH8.0（）：242gTris57.1mlAceticAcid37.2gEDTA二．畢赤酵母表達(dá)的培養(yǎng)基配制［

5］2.1LB

（Luria－Bertani

）培養(yǎng)基：lTryptonYeastExtract0.5

％

％NaClPH7.0

l

％制作平板時加

2％瓊脂。℃壓滅菌用于培養(yǎng)pPICZA原核宿主菌TOP10F加入Zeocin25ugml2.2（Salt）培養(yǎng)基：lTryptonYeastExtract0.5

。％

％NaClPH7.0

0.5％制作平板時加入2瓊粉?！娓邏簻?0min?？捎谑覝卮鏀?shù)月用培養(yǎng)pPICZA核主菌

TOP10F’，加入25ug/條下保存2。2.3）YeastExtractPeptoneDextrose，（YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉胰蛋白胨右旋萄糖培養(yǎng)基）Trypton2%dextrose(glucose)2%+agar2%+Zeocin100μ液體YPD培養(yǎng)基可常溫保存；瓊脂YPD平板在可保存幾個月。入Zeocin100ug/ml，成YPDZ培養(yǎng)基，可以

條件下存

。2.4YPDS+Zeocinyeastextract1%peptone2%

培養(yǎng)基（ExtractPeptoneDextroseMedium

）：dextrose(glucose)2%sorbitol+agar

M%+Zeocin100μ不管是液體

培養(yǎng)基，都必存放

4℃件下，有效期

1～周2.5MGYMinimalGlycerolMedium

（最小甘油培基）

；甘油；滅100ml2ml的500*B液和100ml10*GY母液混勻即可，℃保存，保存為2.6MGYH

2個月。MinimalGlycerolMedium+Histidine

（最小甘油培基

+0.004%

組氨酸）在1000ml的MGY培養(yǎng)基中加10ml的母液混，℃保，保存為2月。2.7RDRegenerationDextroseMedium

（葡萄糖再生養(yǎng)基）（含有：的梨醇；葡萄糖1.34%YNB；4*10-5%生物素氨基酸）1.將186g的山梨醇定容至

，高壓滅菌；冷卻后于℃水?。粚?00ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和無菌水混勻，預(yù)熱至℃后，與步驟的山梨溶液混合。存。2.8RDHRegenerationDextroseMedium+Histidine酸）

（葡萄糖再生培養(yǎng)基+0.004%組氨在RD培養(yǎng)基配制的第三步中在加入

10ml100*H液同時無水的體積減少至即可，其余配制方法與相同。℃保存。2.9RD及RDH平板的制備將186g的山梨和15~20g瓊脂粉容至，高壓菌；冷后于℃浴；參照RD/RDH液體培養(yǎng)基制的步100ml的10*D、100ml的10*YNB；的500*B；的100*AA母液、（10ml的100*H液）和（）菌水混勻，預(yù)熱至℃后，與步驟1的山梨脂液混勻；3.迅速制備平板。℃可保數(shù)月。2.10RD及的TOP瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被）將186g的山梨醇和瓊脂粉定容至

高壓滅菌；冷卻后于℃水??；參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟

將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；的100*AA母液、（10ml的100*H液）和（）菌水混勻，預(yù)熱至℃后，與步驟1的山梨脂液混勻；將該TOP瓊脂置于℃水浴冷卻、保溫，備用。2.11MD與MDHMinimalDextroseMedium+（Histidine）

最小葡萄糖培養(yǎng)基+（%組氨酸）（含有：1.34%YNB；；4*10-5%生素；葡萄糖）1.100ml的10*YNB的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌定容至1000ml即可；2.如配制MDH，可在上述的

MD中加入的100*H可；3.如配制平板，可無菌水的滅菌前，加入2.12SOC培養(yǎng)基：

15~20g的瓊脂。可保存數(shù)月。Trypton

l

％℃高壓滅菌

YeastExtract0.5NaCl0.05Glucose(1mol/L)，卻后，℃保存

％％三．主要試驗環(huán)節(jié)的操作3.1酵母菌株分離純化接種GS115于5mlYPD液體培養(yǎng)基，℃，200rpm振蕩過夜，涂YPD平板，℃培養(yǎng)小時，用YNB基本培養(yǎng)基和含His的補充培養(yǎng)基作點種分離純化，挑

3.2pPICZA原核宿主菌TOP10F’做為菌種保存在－

TOP10F’活化培養(yǎng)℃條件下，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)抽提質(zhì)粒之前先要進(jìn)行活化培養(yǎng)。接種TOP10F于（入25ugml）中℃200，培養(yǎng)～18時。畢赤酵母表達(dá)的試驗方法3.3.1狀質(zhì)粒DNA的脫磷酸化處理為了防止載體質(zhì)粒的自用小牛腸堿性磷酸酶（質(zhì)粒DNA，具體操作如下：⑴建立反應(yīng)體系：線性化的質(zhì)粒

35ul10xCIP4ulCIPddH2O5ul———————————————————total45ul⑵PCR儀上控制反應(yīng)溫度（加石蠟油封閉），℃，30（滅活）。

℃，15min

50℃，15；⑶℃未開始前停止，加入

proteinseK，用于滅活加入試劑如下：反應(yīng)物

45ul10x％SDS10xEDTA（pH8.0

7ulproteinseKddH2O

ulul——————————————————total70ul⑷純化使用

QIAquickspinkit

，按照步驟進(jìn)，20ul菌洗脫純化產(chǎn)物。行

1％脂糖凝膠電泳，

120V觀察純化結(jié)果，并大約估計

DNA濃度。3.3.2E.coliTOP10F

’感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化⑴10ulTOP10F液，接種于200mlLB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，℃200rpm，～18時。取100菌液接種于

200ml液體LB培養(yǎng)中。37℃200培養(yǎng)～18時。滅菌500ml心管，，4000，20min。得菌體沉淀。棄上清，菌體用％甘油重懸并洗滌。重復(fù)洗滌

。⑷第三次離心后，棄絕大部分上清，留下約

1ml液體用于重懸體。⑸從制得的感受態(tài)細(xì)胞中，取

200ul于滅菌EP中，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物

，混勻，不要產(chǎn)生氣泡，在冰上放置

5⑹將混勻后得200ul液移入電擊杯中。⑺使用電擊穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化，設(shè)置為

電壓2500V，時間5ms。⑻電擊后，往電擊杯中加入

800ul培養(yǎng)基，沖洗出菌體，轉(zhuǎn)移至滅菌1.5mlEP管中。℃，150rpm，輕搖～60。⑼取全部均勻涂布于含

Zeocin25ug/ml

的Zeocin板上，正放，待涂布液不在流動，℃養(yǎng)～16時。*：設(shè)空載體做對照。3.4

畢赤酵母電轉(zhuǎn)方法3.4.1菌體的準(zhǔn)備：1.挑取酵母單菌落，接種至含有250~300r/min培養(yǎng)過；

5ml培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，℃、2.取100~500μl的培養(yǎng)物種至含有

鮮培養(yǎng)基的三角搖瓶中，℃、250~300r/min培養(yǎng)過，至OD600達(dá)到1.3~1.5；將細(xì)胞培養(yǎng)物于，1500g離心5min，用500ml的冰預(yù)的無菌水將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用250ml的冰預(yù)冷的無水將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用的冰預(yù)冷的按步驟3離心，用的冰預(yù)冷的積約為1.5ml；

1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體7.備注：可將其分裝為μl份的包裝冷凍起來，但會影響其轉(zhuǎn)化效率（內(nèi)）。3.4.2電擊轉(zhuǎn)化：

2周之8.將5~20線性化DNA溶解在5~10lTE溶液中，與μl上述步驟6所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；9.將電轉(zhuǎn)化杯冰浴

；根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料，參考其他文獻(xiàn)及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)行電擊；電擊完畢后，加入冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中12.將菌體懸液涂布于

MDRDB平板上，每

μl布一塊平板；13.將平板置于℃培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)。推薦：電壓電容μF；電阻Ω。電擊時間為10msec。3.5Pichia

3.5.1

模板的處理：1.平板上的菌落長到肉眼可見時（約

小時）2.將除了模板之外的其它

PCR反應(yīng)液的組分備好，并分裝。引物最好使用Kit中已有的檢測專用的引物，或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物（這樣做可以鑒定非定向克隆的方向）；用半根滅菌的牙簽（節(jié)約，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一個滅菌的毫升離心管，對PCR管和毫升離心管編號；PCR擴(kuò)增，％agarose電；對于PCR擴(kuò)增顯現(xiàn)特異性條帶的克隆，把置于毫升離心管中的半截牙簽扔到5升YPDZ培養(yǎng)基中，度培養(yǎng)，小時后提質(zhì)粒，酶切鑒定確認(rèn)。注意：本驗方法應(yīng)用在需要挑取克隆較多（也就是克效率低），使用篩可以使工作量大為降低。3.5.2PCR反應(yīng)體系：

PCR初以TaqDNA

聚合酶反應(yīng)為例：組分μl體系μl體系10xReactionBuffer5.0μl2.0μ25mmol/LMgCl23.0μl1.2l2.5mmol/LdNTPs5.0l3.0μlPrimer1μmol/L）μl1.0Primer2μmol/L）μl1.0ddH2O31.5μl12.6l

l

μμTaqDNA聚合酶μl0.2TOTAL50.0μμl

μ

l3.5.3PCR反應(yīng)條件：初始變性℃4min變性℃30s34

個循環(huán)退火50~5430s延伸℃30s結(jié)束延伸℃10min保存℃3.6畢赤酵母因組提取方法⑴種重組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于

5mlYPDZ培養(yǎng)基，GS115菌于YPD培養(yǎng)基作對照，℃，培養(yǎng)～小時。室溫下，1500g心收集菌體100ulTE（pH7.0）重懸，入ulEDTA（8.0）0.07M，β-基乙醇，1ulLyticase，℃水。⑷離心5~10min，沉淀，加

90ul重懸。⑸200ul飽和酚，200ul氯，混勻，離心30s取上層水相。⑹入兩倍體積無水乙醇以及

1/10體積的NaAC，-20℃置30min；⑺10000g離心20min，棄上；75%乙醇漂洗沉淀一次；⑻燥后，加入

μlTE或H2O溶解，-20℃?zhèn)溆谩?.7表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實驗1.挑選一單菌落，置于裝有

25mlMGYBMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶，于28-30C/250-300rpm培養(yǎng)至OD600=2-6(~16-18h)；2.室溫下1500~3000g離心5min，收集菌體，用MM、OD600=1.0左右（約100~200ml；

或BMMY

重懸菌體，使3.將步驟2所得的液置于

的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30C/250-300rpm的搖床上繼續(xù)生長；4.每24h向培養(yǎng)基中添加

％甲醇至終濃度

～；5.按時間點分別取菌液樣品，取樣量為

置于1.5ml管中，最大轉(zhuǎn)速離心2~3min，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時間。時間點一般?。?、、、、、、和；對分泌表達(dá)，分離樣品的上清液；對胞內(nèi)表達(dá)，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測樣品用液氮或干冰速凍后，于-80°C保存?zhèn)溆茫豢梢杂肧DS、Western-Blot活性實驗檢測與鑒定重組蛋白的表達(dá)。3.7Muts表重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實驗1.挑選一單菌落，置于裝有

25mlMGYBMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶，于28-30C/250-300rpm培養(yǎng)至OD600=2-6(~16-18h)；2.，收集菌1/5到或

重懸菌體（約

10~20ml）；3.將步驟2所得的液置于

的瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30C/250-300rpm的搖床上繼續(xù)生長；4.每24h向培養(yǎng)基中添加

％甲醇至終濃度

～；5.按時間點分別取菌液樣品，取樣量為

置于1.5ml管中，最大轉(zhuǎn)速離心2~3min，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時間。時間點一般取：、、、和120h6.對分泌表達(dá)分離樣的上清；對胞內(nèi)表達(dá)分離樣的菌體淀，帶檢測樣品用液氮或干冰速凍后，于°保備用；7.可以用SDS、Western-Blot活性實驗檢測與鑒定重組蛋白的表達(dá)。四試驗的注意事項信號肽識別位點的設(shè)計以質(zhì)粒A為例。在利PCR反應(yīng)在外源基因兩端引入酶切位點的試驗中。如果質(zhì)粒α雙酶切中失了KEX2蛋白酶的酶切位點－，應(yīng)該在上游中，增加了編碼、Arg的密碼子AGA。酵母細(xì)胞膜中中的KEX2蛋白酶是信號肽的切割酶，它能有效識別酶切位點－，過對信號肽的切割使基因表達(dá)產(chǎn)物釋放至胞外。4.2PCR產(chǎn)物酶切保護(hù)堿基的設(shè)計利用轉(zhuǎn)換酶切位點，通過、P4兩引物的擴(kuò)增在的兩端加上Ⅰ、XbaⅠ的識別位點和5個保護(hù)基。根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的工作原理，內(nèi)切酶首先需要結(jié)合到核苷酸序列上，并在上面進(jìn)行滑行，直至識別到酶切位點，為了能使內(nèi)切酶有效的結(jié)合到序列上以利于其的有效加工。在利用PCR進(jìn)行酶切位點轉(zhuǎn)換的時候，通常應(yīng)在端限制酶位點外再加保護(hù)堿基GC6，防止引物合成中因為合成效率和純化問題而導(dǎo)致的酶切位點的殘缺。核苷酸保護(hù)堿基之為了保證限制型內(nèi)切酶的工作效率，在其識別位點的兩側(cè)應(yīng)該保證一定的旁側(cè)序列，換言之，識別位點是限制型內(nèi)切酶識別并特異性切割底物的必要而不充分的條件。鑒于NEB(NewEnglandBiolabs)公司在限制酶領(lǐng)域的總體研究水平和對保護(hù)堿基方面的獨到理解，在設(shè)計引物時可以參照NEB公司產(chǎn)品目錄后面的附錄：CleavagetotheendofDNAfragments

進(jìn)行［7］，是，一些不常用的酶或雖有推薦的保護(hù)堿基序列但酶切效率仍不高的酶還是很難設(shè)計保護(hù)堿基。本次實驗中，根據(jù)美國基因動力實驗室文獻(xiàn)的報道［］；XbaINheI和SpeI位點端保護(hù)堿基須在5個左右才容易被酶切割，以一些前人的經(jīng)驗總結(jié)，我們在設(shè)計引物時在識別位點端，設(shè)計了5個保護(hù)堿基。以保證較高酶切效率。高保真聚合酶的Vent聚酶是從高溫嗜熱菌分高出的高保真（Fidelity

DNA聚合酶，能糾正DNA擴(kuò)增中產(chǎn)生的錯誤，而傳統(tǒng)的

TaqDNA聚合酶，DNA聚合酶及其變體AmpliTaqKlenTaq等都無至’糾錯功能因此在擴(kuò)增時出現(xiàn)堿基錯配的機(jī)率為。對于大批量的PCR產(chǎn)物而言，并不是十分嚴(yán)重的問題，因為又同樣錯誤的DNA分子僅占全部合成的DNA分子群體的極少一部分。但是，如果PCR擴(kuò)增的DNA片段是用于分子克隆，那么這就是件值得重視的事情，因為此種分子含有一個或數(shù)個錯誤摻入的核苷酸，那么在該克隆中的所有克隆DNA都將帶有同樣的“突變”。將會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果［］。具有校正功能的DNA聚合酶還有Pfu，DeepVent，Pwo，UlTma等，Pfu是中出錯率最低的，比TaqDNA聚合酶低倍在本論文中，為了減少hEGF在PCR過程的錯誤擴(kuò)增，在人工合成hEGF的過程中使用了Vent聚合酶。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展成熟（擴(kuò)增長度、保證性、產(chǎn)量和特異性等），質(zhì)粒構(gòu)建過程的大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制將被PCR這一細(xì)胞外的DNA復(fù)制所代替，質(zhì)粒構(gòu)建效率將有質(zhì)的飛躍。密碼子的偏好性的原則酵母菌對外源基因的表達(dá)也和外源基因密碼子的選用有關(guān)。了解表達(dá)系統(tǒng)宿主在密碼子使用上的偏愛性對從翻譯水平分析外源基因表達(dá)的規(guī)律有重要意義也為改造外源基因或改造宿主細(xì)胞提供依據(jù)［、］。線性化及采用電轉(zhuǎn)化的原因：在pPICZA-EGF電轉(zhuǎn)整合入GS115的時候，因為需要比較高的轉(zhuǎn)染率，我們對其用限制性內(nèi)切酶Sac進(jìn)行線性化的處理。細(xì)菌內(nèi)同源重組被認(rèn)為是重組質(zhì)粒構(gòu)建過程的難點。因為未線性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低，所以重組轉(zhuǎn)移載體必須用特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理。這種處理的目的：防止隨機(jī)插入重組時質(zhì)粒在功能區(qū)斷開，造成目的基因表達(dá)失活；讓同源重組以指定的方式發(fā)生。4.5乙醇沉淀的問題主要步驟如下：1酶切體系（80ul）中2倍積的無水乙醇加分鐘沉淀3)13200rpm，20min，心后棄上清

1/10體積的NaAC，混4)75%乙醇300ul輕輕洗，同上離心

，棄上清37度烘箱至無乙醇?xì)馕叮ɑ蚴怯脫u床的出風(fēng)口吹出的暖風(fēng)吹）。20ulddH2O重溶如果想提高轉(zhuǎn)化效率，可以稍微做一些改進(jìn)：還是用酚抽一下，去除內(nèi)切酶；75%乙醇應(yīng)兩遍，盡可能去除鹽離子，防止電轉(zhuǎn)化杯被擊穿，同時可提高效率；在沉淀時，如用終濃度2.5M醋酸鈉+2.5體積的無水乙醇，可沉淀幾乎所有的DNA，但需要用75%的乙醇認(rèn)真的洗兩遍。6酶切的總影響重組質(zhì)粒構(gòu)建效率的最關(guān)鍵步驟在于酶切，不管是否是定向克隆還是非定向克隆。酶切的關(guān)鍵在于切干凈，徹底的酶切反應(yīng)是成功的一半，特別是載體的酶切，尤其是雙酶切。雙酶切一般是先反應(yīng)低鹽的、后反應(yīng)高鹽的，如果低鹽的酶在高鹽的的反應(yīng)條件下有低活性（一般來講在NEB的手冊上都有標(biāo)示），最好就先純化（酚氯仿抽提、乙醇沉淀過，再進(jìn)行第二次酶切反應(yīng)。注意：有相同