實驗七凝集素對細胞的凝集反應細胞融合（聚乙二醇法）細胞生物學實驗實驗目的通過細胞的凝集反應的觀察了解細胞膜的表面結構了解細胞發(fā)生凝集反應的原因學習研究細胞凝集反應的方法通過細胞融合的觀察了解細胞融合的原理掌握用PEG誘導細胞融合的方法實驗原理細胞凝集反應細胞膜的基本成份是膜脂和膜蛋白質，膜脂和膜蛋白又可被糖基化成糖脂和糖蛋白，分枝狀的糖基主要位于質膜外側構成細胞表面的糖外被;凝集素廣泛存在于植物，動物和微生物中，是一類可逆結合特異糖基的蛋白質，能與細胞膜外被的寡糖鏈相連接，使細胞發(fā)生凝集;一種凝集素具有對某一種特異性糖基專一性結合的能力糖被的結構和組成示意圖凝集素的作用機制常見的凝集素一覽表凝集素縮寫特異性結合花生（Peanutagglutinin）PNAD—半乳糖、Gal(1→3)—GalNAC刀豆（Concanavalin

ensifomisagglutinin）ConAD-葡萄糖、D-甘露糖蓖麻（Ricinus

communisagglutinin）RCAD—半乳糖、D-GalNAC>半乳糖扁豆（Lenscuinarisagglutinin)LCAD-甘露糖、D—葡萄糖豌豆（Pisum

satiwumagglutinin）PSAD-甘露糖菜豆（Phaseolus

vulgarisagglutinin）PHAD-GalNAC大豆（soybeanagglutinin）SBAD-GalNAC>>D-半乳糖荊豆（Ulex

europeausagglutinin）UEAL-巖藻糖麥胚(Wheatgermagglutinin)WGAD-GalNAC、NANA(Bandeiraea

simplicifoliaagglutinin)BSAD-半乳糖雙花扁豆（Dolichos

bifowsagglutinin）DBAD-GalNAC槐（Sophorajaponicaagglutinin）SJAD-半乳糖、D-GalNAC實驗原理細胞融合細胞融合是指兩個或兩個以上的細胞合并成為一個具有雙核或多核細胞的過程。在自然情況下，體內和體外培養(yǎng)的細胞均能發(fā)生自發(fā)融合現象;細胞融合可在自然條件下或利用人工條件(生物的、物理的、化學的)下進行;聚乙二醇分子能改變各類細胞的膜結構，使兩細胞接觸點處質膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發(fā)生融合,形成雙核或多核細胞;融合的頻率和活力與所用PEG的分子質量、濃度、作用時間、反應溫度、細胞的生理狀態(tài)與密度等有關。通過有絲分裂，細胞核便發(fā)生融合，形成雜種細胞。誘導細胞融合的主要方法1.生物法病毒誘導融合：有許多種類的病毒能介導細胞融合，最常用的是滅活的仙臺病毒（HVJ），為RNA病毒。病毒誘導細胞融合的過程有：首先是細胞表面吸附許多病毒粒子，接著細胞發(fā)生凝集，幾分鐘至幾十分鐘后，病毒粒子從細胞表面消失，而就在這個部位鄰接的細胞的細胞膜融合，胞漿相互交流，最后形成融合細胞。2.化學法化學融合劑誘導融合：化學融合劑主要有高級脂肪酸衍生物、脂質體、鈣離子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白質和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。PEG用于細胞融合至少有兩方面的作用：①可促使細胞凝集；②破壞互相接觸處的細胞膜的磷脂雙分子層，從而使相互接觸的細胞膜之間發(fā)生融合，進而細胞質溝通，形成一個大的雙核或多核融合細胞。

3.物理法電融合：是指細胞在電場中極化成偶極子，并沿著電力線排列成串，然后用高強度、短時程的電脈沖擊穿細胞膜而導致細胞融合。激光誘導的細胞融合：利用短脈沖激光微束的亞微米作用范圍、高峰值功率、短作用時間，可以在兩樣品接觸區(qū)的質膜層形成亞微米量級的通透性孔徑，完成孔徑周圍磷脂分子的高密度激發(fā)重組形成質膜融合。圖2用高強度、短時程的電脈沖擊穿細胞膜而導致細胞融合。

圖1細胞在高頻交流電場中極化成偶極子，并沿著電力線排列成串PEG結構式：CH2（OH）-（CH2CH2O）n-CH2OH(n為聚合度)高分子化合物,分子量根據聚合度的不同而不同,常溫下平均分子量200～600者為液體700～2000者為半固體(白色蠟狀固體)4000～6000者為白色粉末狀8000,10000,20000易溶于水液體粘度隨分子量增加而增加體細胞雜交細胞融合又稱體細胞雜交最初兩個細胞只有胞漿合在一起，核各自獨立在隨后的有絲分裂中，兩種細胞的染色體才彼此混合在一起，這時則叫合核體的雜種細胞。基因型相同的細胞融合成的雜交細胞稱為同核體(homokaryon)來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體(heterokaryon)。實驗用品實驗材料馬鈴薯塊莖、雞全血、兔全血實驗試劑磷酸緩沖液(PBS),pH7.250%聚乙二醇(PEG,MW=4000)GKN液生理鹽水0.2%JanusGreenB

抗凝劑:肝素溶液(200μg/ml)

實驗器材顯微鏡、離心機、水浴鍋、研缽、鑷子、凹面載玻片、蓋玻片、吸管、試管、離心管等50%（m/V）PEG溶液取50gPEG4000放入100mL瓶中，沸水溶化(如需后續(xù)研究，高壓滅菌20min)讓PEG冷卻到50~60℃，勿讓其凝固加入50mL預熱至50℃的GKN液，混勻，至37℃保溫備用。GKN液氯化鈉8g氯化鉀(KCl)0.4gNa2HPO4?2H2O1.77gNaH2PO4?H2O0.69g葡萄糖2g酚紅(phenolred)0.01g溶于1000ml重蒸水中。實驗內容馬鈴薯凝集素對兔血紅細胞的凝集作用PEG誘導雞血細胞融合實驗步驟馬鈴薯凝集素對兔血紅細胞的凝集作用2%兔血紅細胞制備取兔全血(加肝素抗凝劑)1ml,移入10mL離心管,加入4mL生理鹽水混勻,3000rpm離心3min,離心洗滌3～5次(Why?)把最后的沉淀轉至1.5mlEP管中，3000rpm離心3min，最后按壓積紅細胞體積加生理鹽水配成2%兔血細胞液。馬鈴薯凝集素提取稱取馬鈴薯去皮塊莖2g，加少許磷酸緩沖液研磨成勻漿，最終加入磷酸緩沖液15ml

，浸泡0.5～1h，浸出的粗提液中含有可溶性馬鈴薯凝集素。細胞凝集反應觀察吸取馬鈴薯凝集素粗提液1滴置凹玻片上,分別加血細胞液1滴,充分混勻，加蓋玻片,靜置片刻后于光學顯微鏡下觀察細胞凝集現象。2%兔血紅細胞懸液2%雞紅細胞懸液對照:磷酸緩沖液代替凝集素粗提液作為對照觀察。實驗結果馬鈴薯凝集素對兔血紅細胞的凝集作用PBS對照實驗步驟PEG誘導雞血細胞融合2%雞紅細胞懸液制備取抗凝全血1mL，移入10mL離心管，加入4mL生理鹽水混勻，3000rpm離心3min。重復洗滌1次。棄去上清，加GKN液4ml，再洗滌離心1次；收集最后1次離心沉淀的血細胞，加入適量的GKN溶液，轉入1.5mlEP管,3000rpm離心3min，按壓積紅細胞體積配成2％的紅細胞懸液（用GKN配制，可以用血球計數板計數將其調整約為107個/ml)細胞融合的誘導取以上細胞懸液1ml放入10ml的離心管中，置40℃水浴中預熱，同時將50％PEG液一并預熱20min；取0.5ml的50％PEG溶液逐滴沿離心管壁加入到細胞懸液中，邊加邊搖勻，置40℃水浴中保溫1-10min

(可處理1,2,3,4,5,10min取樣)，染色鏡檢實驗步驟PEG誘導雞血細胞融合(續(xù)上)染色鏡檢加1滴GKN液于載玻片上,再加1滴PEG誘導后血細胞懸液，混勻，加入0.2%JanusGreenB染液1滴，混勻，染色5-15min后,蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察觀察細胞融合狀況;注意辨別融合細胞與重疊的雞紅細胞計算融合率(%)融合率=融合細胞數/總細胞數×100%細胞融合率是指在顯微鏡的一個視野內，已發(fā)生融合的細胞核總數與該視野內所有細胞(包括已融合的細胞)的細胞核總數之比，通常以百分比表示,而且要進行多個視野測定，進行統(tǒng)計分析。觀察時注意不同程度的融合現象通常分為五個階段。①兩細胞膜接觸，粘連；②細胞膜形成穿孔；③兩細胞的細胞質連通；④通道擴大，兩細胞連成一體；⑤細胞完全合并，形成一個含有兩個或多個核的圓形細胞。

實驗結果