乳酸菌得分離培養(yǎng)桿菌組長:組員:實驗?zāi)康?1.學習并掌握普通光學顯微鏡油鏡得使用技術(shù)及微生物形態(tài)觀察;2。學習微生物制片、染色得基本技術(shù),掌握乳酸菌得簡單染色法及無菌操作接種技術(shù);養(yǎng)基得配制,了解配制培養(yǎng)基得一般步驟與方法,掌握微生物實驗常用得器皿得清洗與包扎、培基得制備、消毒滅菌。4.了解各種滅菌得基本原理與應(yīng)用范圍,以及實驗室中常用得滅菌方法。5。了解酸奶中乳酸菌分離原理,觀察乳酸菌得基本形態(tài),掌握用顯微鏡測微尺測量微生物細胞大小、數(shù)進行微生物計數(shù)得方法。7。初步學會乳酸菌培養(yǎng)得基本技術(shù),了解并掌握細菌鑒定中常用生理生化反應(yīng)得原理與方法,掌握進行微生物大分子水解試驗得原理與方法。8.了解并掌握微生物菌種保藏得常用方法及其優(yōu)缺點,并了解不同微生物對不同得生物大分子得分解利用情況,認識微生物代謝類型得多樣性。實驗原理:乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸得一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌得總稱,本實驗中用革蘭氏染色法進行染色,革蘭氏染色法就是根據(jù)細菌細胞壁成分不同,脫色效果不同從而可以將細菌區(qū)分為G+與G－菌。通過革蘭氏染色以及形態(tài)學觀察,乳酸菌呈紫色,為革蘭氏陽性菌;乳酸菌應(yīng)為乳桿菌與乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌四種菌。細菌及其它一些微生物得大小,通常用測微計來測量,測微計分接目測微計與鏡臺測微計;培養(yǎng)基就是按照微生物生長發(fā)育得需要,用不同組份得營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成得營養(yǎng)基質(zhì);滅菌就是用物理或化學得方法來殺死或除去物品上或環(huán)境中得所有微生物,包括芽孢;自然條件下,微生物常以群落狀態(tài)存在,這種群落往往就是不同種類微生物得混合體,為了研究某種微生物得特性或者要大量培養(yǎng)或者使用某種微生物,必須從這些混雜得微生物群落中獲得純培養(yǎng),這些獲得純培養(yǎng)得方法稱為微生物得分離與純化。用生化試驗得方法檢測細菌對各種基質(zhì)得代謝作用及其代謝產(chǎn)物,從而鑒別細菌得種屬,稱。樣品:含乳酸菌得酸奶①培養(yǎng)基:改良MRS固體培養(yǎng)基蛋白胨5g牛肉膏5g乙酸鈉2.5gK2HPO41g酵母提取物2。5g檸檬酸二銨1g水500mL儀器用品:500ml燒杯一個100ml量筒一個5ml無菌移液管高壓滅菌鍋無菌培養(yǎng)皿12個水浴鍋一個微尺微尺牛皮紙酒精燈一盞板載玻片若干紙液體石蠟架、洗瓶、酒精燈火柴、滴管玻棒一根棉花麻繩角匙恒溫培養(yǎng)箱鏡旋渦均勻器一臺布接種環(huán)一個酸度計載玻片鏡臺測蓋玻片血球計數(shù)擦鏡紙、吸水藥品:結(jié)晶紫,乙醇,草酸銨,碘,碘化鉀,番紅,KOH,NaCl,10%NaOH,2%氯化鐵、結(jié)晶紫:結(jié)晶紫乙醇飽與液(結(jié)晶紫2g溶于20ml95%乙醇中)20ml,1g草酸銨于蒸餾水100ml。將兩液盧戈氏碘液:碘1g,碘化鉀2g,蒸餾水300ml、先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸餾水300ml即成。即成,按1:100稀釋即可。生理鹽水:稱取0.9克氯化鈉,溶解在少量蒸餾水中,稀釋到100毫升。gggg乙酸鈉0.5g,KHPO．2g,MnSO4·4H2O0.025g,MgSO4·7H2O0.06g,葡萄糖2g,吐溫800.1mL,CaCO31g放入燒杯、2、溶解向上述燒杯中加入蒸餾水50mL無菌水,用玻璃棒攪勻后,放到酒精燈上加熱,在石棉網(wǎng)上加熱H到6.8左右、5.培養(yǎng)基得分裝將培養(yǎng)基趁熱分裝到2個三角瓶里(一半為宜)、注意:分裝時不要將培養(yǎng)基沾在管口與試6.加棉塞培養(yǎng)基分裝完畢以后,在管口上加一個棉塞、棉塞能防止雜菌污染,保證通氣良好。加棉塞時,應(yīng)使棉塞長度得2／3在試管口內(nèi)。7。包扎在管口外面包上一層牛皮紙,然后,用線繩扎好。在每捆試管外掛上標簽,注明培養(yǎng)基名稱、配制日期與制作者姓名1、打開高壓蒸汽滅菌鍋,將里面得滅菌桶取出,向鍋內(nèi)加水(最好用開水),水面與底架平齊為宜(直至高水位燈亮起)、2。將扎好得試管管口向上豎放在滅菌桶內(nèi),再將滅菌桶放回滅菌鍋。(注意:滅菌桶內(nèi)得物品不能放得太擠,否則會影響滅菌效果)。同時關(guān)閉滅菌鍋上方得安全閥,打開排氣閥,使水沸騰時得以排除鍋內(nèi)得冷空氣、5.排出鍋內(nèi)得冷空氣,關(guān)上排氣閥,讓鍋內(nèi)得溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升,當鍋內(nèi)得壓力上升到98kPa6。滅菌所需時間到后,切斷電源,讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降,當壓力表得壓力將至0時,打開排氣閥,旋開蓋將取出得滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫箱保溫培養(yǎng)24小時,經(jīng)檢查若無雜菌生長,即可待用。先將酸奶樣品攪拌均勻,用無菌移液管吸取樣品10ml加入盛有90ml無菌水得三角瓶中,在旋渦均勻器管中,吹息三次,使充分混勻。然后再用一支1ml無菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一盛有9ml無菌水A、涂布平板法用三支1ml無菌吸管分別吸取10－5、10－6與10-7得稀釋菌懸液各1ml,對號接種于與之對應(yīng)得3個無菌平板中,每個平皿放0。2ml;盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻,平放與試驗臺上20Min;然后倒置于40℃恒溫箱中培養(yǎng)48小時。常用得劃線方法有;(a)用接種環(huán)以無菌操作挑取菌液一環(huán),先在平板培養(yǎng)基得一邊作第一次平行劃線3-4條,再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角,并將接種環(huán)上剩余物燒掉,待冷卻后通過第一次劃線部分做第二次平行劃線,再用同法通過第二次平行劃線部分做第三次平行劃線與通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線、劃線完畢后,蓋上皿蓋,倒置于放在40℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。(b)將挑取有樣品得接種環(huán)在平板培養(yǎng)劃線完畢后,蓋上皿蓋,倒置于放在40℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。l50℃左右培養(yǎng)基中,邊倒入邊搖勻,使樣品中得微生物與培養(yǎng)基混合均勻,到冷凝成平板后,倒置于40℃恒3七、菌落特征得觀察?恒溫培養(yǎng)48小時過后,取出培養(yǎng)平板;選擇菌落分布較好得平板,先對其菌落形態(tài)(如菌落得大小、表面狀況、透明度、色澤、邊緣、隆起度、透光性、就是否分泌色素等特點)進行觀察,初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌得菌落很小,大約1~3mm,園形隆起,表面光滑或稍粗糙,呈乳白色、灰白色或暗黃色;在產(chǎn)酸菌落周圍還能產(chǎn)生CaCO得溶解圈。?八、乳酸菌得形態(tài)觀察及保加利亞乳桿菌3)普通光學顯微鏡得使用1。取鏡從顯微鏡箱中取出顯微鏡時,用一手握鏡臂,一手托鏡座,直立移動,輕放在平穩(wěn)得實驗臺上,使用前首先要熟悉顯微鏡得結(jié)構(gòu)與性能,檢查各部零件就是否齊全,鏡頭就是否清潔,做好必要地清潔與調(diào)整工調(diào)節(jié)光照1)用粗調(diào)節(jié)器提升鏡筒,將低倍物鏡旋到鏡筒下方,使鏡頭與載物臺距離約為5mm左右。物臺表面相距1毫米左右。3)插上電源,開開電源開關(guān)。左眼瞧目鏡調(diào)節(jié)反光鏡鏡面角度(在天然得光線下觀察,一般用平面反鏡;若以燈光為光源,則一般多用凹面反光鏡)。4)開閉光圈,調(diào)節(jié)光線強弱,直至視野內(nèi)得到最均勻最適宜得光度為止。3。低倍鏡觀察1)將載片標本(涂面朝上)置于載物臺得標本夾上,并將標本部位處于物鏡得正下方,轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器,使鏡5mm處。2)然后以左眼瞧目鏡,另一眼睜開,一邊觀察視野,一邊扭動粗調(diào)節(jié)器使鏡頭緩慢地升高,至視野內(nèi)出現(xiàn)物像后,改用細調(diào)節(jié)器上下微微轉(zhuǎn)動,仔細調(diào)節(jié)焦距與照明,直至視野內(nèi)獲得清晰得物像,選擇適宜部位,移到視野中心。3)移動推動器,換高倍鏡觀察。4.高倍鏡觀察將高倍物鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方,調(diào)節(jié)光圈與聚光鏡,使光線亮度適中,再仔細反復轉(zhuǎn)動微調(diào)螺旋,調(diào)節(jié)焦距,獲得清晰物象,再移動推動器選擇最滿意得鏡檢部位將染色標本移至視野中央,待油鏡觀察。1)先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升(或?qū)⑤d物臺下降)約2cm,轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒正下方。在玻片標本得鏡檢部位滴上一滴香柏油。從側(cè)面注視,用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺緩緩地上升,使油浸物鏡浸入香柏油中,使鏡頭幾乎與標本接觸。2)左眼瞧目鏡,右手反時針方向微微轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋,下將載物臺,當視野中有模糊地標本物象時,改用細調(diào)螺旋,并移動標本直至標本物象清晰為止。3)觀察完畢,下降載物臺,將油鏡頭轉(zhuǎn)出,先用擦鏡紙擦去鏡頭上得油,再用擦擦鏡紙蘸少許二甲苯或乙醚酒精混合液(乙醚2份,純酒精3份),擦去鏡頭上殘留油跡,最后再用擦鏡紙擦拭2~3下即可,(注意向一個方向擦拭)。4)將各部分還原:下降載物臺最低處;轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器,使物鏡鏡頭轉(zhuǎn)成八字形,再向下旋轉(zhuǎn)至最低處;將調(diào)節(jié)光源亮度得旋鈕最小化;關(guān)掉電源;用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分,放好顯微鏡,蓋上罩。(如果就是自然采光顯微鏡,降下聚光器,反光鏡與聚光器垂直)。標本片,必須從第三條開始操作。、復原觀察完畢,上旋鏡筒,先用擦鏡紙擦去鏡頭上得油,然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯(香柏油溶于二甲苯)擦去鏡頭上得殘留油跡,最后再用擦鏡紙擦去殘留得二甲苯、機械部件用細軟布擦去灰塵與冷凝水,下降鏡筒,將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形置于載物臺上。下降聚光鏡,(切勿使接物鏡與聚光鏡相碰受損),反光鏡垂直于鏡座。放進顯微鏡箱中鎖好,并放入指定得面微鏡柜中。1、涂片取干凈載玻片一塊,在載玻片中央加一滴蒸餾水,將培養(yǎng)得乳酸菌作涂片(注意涂片切不可過于濃厚),干燥、固定。固定時通過火焰1—2次即可,不可過熱,以載玻片不燙手為宜、(1)初染加草酸銨結(jié)晶紫染色液一滴,約1一2分鐘,傾去染色液,用自來水小心地沖洗。(3)脫色將載玻片上面得水甩凈,并襯以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止,約20—30秒鐘,立即用水沖凈酒精,以終止脫色。2—3分鐘,水洗。最后用吸水紙輕輕吸干、(5)鏡檢干燥后,置油鏡觀察、革蘭氏陰性菌呈紅色,革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開得乳酸菌得革蘭氏染色反應(yīng)為準,過于密集得細菌,常常呈假陽性、其中保加利亞乳桿菌呈桿狀,成單桿、或雙桿菌或長絲狀;嗜熱鏈球菌,呈球狀,成對、或短鏈、或長鏈狀。十、保加利亞乳桿菌得細胞大小測定1、目鏡測微尺得校正把目鏡得上透鏡旋下,將目鏡測微尺得刻度朝下輕輕地裝入目鏡得隔板上,把鏡臺測微尺置于載物臺上,刻度朝上。先用低倍鏡觀察,對準焦距,視野中瞧清鏡臺測微尺得刻度后,轉(zhuǎn)動目鏡,使目鏡測微尺與鏡臺測微尺得刻度平行,移動推動器,使兩尺重疊,再使兩尺得“0"刻度完全重合,定位后,仔細尋找兩尺第二個完全重合得刻度,計數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺得格數(shù)與鏡臺測微尺得格數(shù)。因為鏡臺測微尺得刻度每格長l0μm,所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表得長度。小格長度為=5×10μm/5=10μm2、菌體大小得測定取下鏡臺測微尺,將保加利亞乳桿菌染色標本片置于載物臺上,先在低倍鏡與高倍鏡下找到目得物、然后在高倍鏡下轉(zhuǎn)動目鏡測微尺,測出保加利亞乳桿菌得長與寬各占幾格(不足一格得部分測微尺測出保加利亞乳桿菌得長與寬各占幾格(不足一格得部分估計到小數(shù)點后一位),測出得格數(shù)乘上目顯微鏡下經(jīng)過校正,當使用油鏡時,每格相當于1.3μm。如果測量菌體得長度相當于目鏡測微尺得兩格,則菌體長度應(yīng)為1.3μm×2=2。6μm、一般測定微生物細胞大小時,通常測量10—20個菌體左右,求出平均值,才能代表該菌得大小、用最大與最小得數(shù)值來表示菌體大小得范圍。例如長為3~5μm,寬為1~2μm,則其大小為l~2×3~5μm。3、取出目鏡測微尺,將接目鏡放回鏡筒,再將目鏡測微尺與鏡臺測微尺分別再用擦鏡紙擦拭后,放回盒內(nèi)保存、存上:俯視圖(中間平臺分為兩半,各刻有一個方格網(wǎng))血球計數(shù)板通常就是一塊特制得厚載玻片,載玻片上有四條槽而構(gòu)成三個平臺(圖5-2)。中間得平臺較寬,其中間又被一短橫槽而隔成兩半,每個半邊上面各刻有一個方格網(wǎng)、每個方格網(wǎng)共分9大格其中間得1大格又稱為計數(shù)室,微生物得計數(shù)就在此大格中進行。常用得血球計數(shù)板得計數(shù)室有兩種規(guī)格得刻度網(wǎng)格。個大其計數(shù)室得小格數(shù)總就是相同得,即16×25＝25×16＝400(小格),見下圖。圖-—計數(shù)網(wǎng)得區(qū)分與分格每一個大方格邊長為lmm、則每一大方格面積為lmm2、蓋上蓋玻片后,載玻片計數(shù)室與蓋被片之間得高度為0。1mm,所以每個計數(shù)室(大方格)得體積為0.1mm3。在計數(shù)時,通常數(shù)5個中方格得總菌數(shù),求得平均值。再乘上16或25就得一大方格中得總菌數(shù)。然后再換算成1mL菌液中得總菌數(shù)。(1mL=1cm3=1000mm3)操作步驟如下:1、取培養(yǎng)后得保加利亞乳桿菌液振蕩混勻,加無菌水適當稀釋(斜面一般稀釋到10－2)。稀釋度選擇以小方格中得分布得菌體清晰可數(shù)為宜、一般以每小格內(nèi)含4~5個菌體得稀釋度為宜。3。將保加利亞乳桿菌液搖勻,用滴管吸取少許,從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)得溝槽內(nèi)沿蓋玻片得下邊緣滴入一小滴(不宜過多),使菌液沿兩玻片間自行滲入計數(shù)室,勿使產(chǎn)生氣泡,并用吸水紙吸去溝槽中流出得多余菌上,然后加蓋蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡)。圈要縮小,光線要偏暗些,并將計數(shù)室移至視野中央、l利亞乳桿菌菌數(shù)(即80個小格)。由于菌體在計數(shù)室中處于不同得空間位置,要在不同得焦距下才能瞧到,因而觀察時必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)如菌體位于大方格得雙線上,計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線,數(shù)左線不數(shù)右線,以減少誤6.在高倍鏡下計數(shù):隨機地計數(shù)5個中格內(nèi)得菌數(shù),然后求得每個中格得平均值、乘上16(或25)就得出1大格中得總菌數(shù),最后再換算到每1mL菌液中得含菌數(shù)量。由于菌體細胞在血球計數(shù)板上處于不同得空間位置,要在不同得焦距下才能瞧到,故觀察時必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)節(jié)器,方能數(shù)到全部菌體以免遺漏。最后用擦鏡紙擦干凈,并放回盒內(nèi)。十二、保加利亞乳桿菌得生理生化試驗接種新鮮得實驗菌種于培養(yǎng)基中,40℃恒溫箱中培養(yǎng)48小時后,取培養(yǎng)液1mL在其中加入1ml10%NaOH,混勻,再加入3—4滴2％氯化鐵溶液、數(shù)小時后,培養(yǎng)基表面得下層出現(xiàn)紅色者,為陽性將表下表所示培養(yǎng)基成分(指示劑除外)稱取、溶解、搖勻,調(diào)整pH值