關(guān)于基因治療的原理第1頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三一、基因治療的策略

內(nèi)容提要二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

三、基因干預(yù)第2頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三一、基因治療的策略第3頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

（一）基因置換（genereplacement）

定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過定位重組，以導(dǎo)入的正常基因置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。

第4頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三（二）基因添加

基因添加或稱基因增補(bǔ)（geneaugmentation）:

通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。類型:在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正常基因，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能。向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。第5頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三（三）基因干預(yù)基因干預(yù)（geneinterference）:采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。第6頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三（四）自殺基因治療自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。第7頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三（五）基因免疫治療

通過將抗癌免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。第8頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)第9頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)技術(shù)

1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。

2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。第10頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。第11頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三(1)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體第12頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)

①逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體識別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。

②逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。

③前病毒可以高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。

④包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。

第13頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn)

隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。第14頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體

腺病毒是一種大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。

腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等。第15頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)1.基因?qū)胄矢撸瑢θ祟惏踩?.宿主范圍廣；3.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；4.重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因；第16頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

腺病毒載體的缺點(diǎn)2.宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。3.有兩個(gè)環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。4.靶向性差。

1.不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細(xì)胞，導(dǎo)入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機(jī)會(huì)增多，表達(dá)時(shí)間相對較短。第17頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。

基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。

第18頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)

將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實(shí)現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價(jià)連接后，又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞吞飲，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。第19頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

（3）基因直接注射技術(shù)不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動(dòng)物肌肉或某些器官組織內(nèi)。

第20頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三三、基因干預(yù)第21頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三基因干預(yù)的種類：1.反義RNA(antisenseRNA)2.干擾RNA(RNAinterference)第22頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

（一）反義RNA1.反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，通常采用的方法有兩種：（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。第23頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三2.受體介導(dǎo)反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù)

基本原理：將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價(jià)連接，得到ASGP-PL復(fù)合物，成為運(yùn)載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復(fù)合物可以專一性地被肝細(xì)胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA進(jìn)入肝細(xì)胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。

借助受體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移方法把DNA換成反義RNA，就可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA的轉(zhuǎn)移。第24頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三（二）干擾RNA

1.RNA干擾現(xiàn)象

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。第25頁，共28頁，2023年，2月20日，星期三

2.RNA干擾的機(jī)制

RNA干擾過程主要有2個(gè)步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。

該復(fù)合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷。

長雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個(gè)堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA，si