PAGEPAGE1構(gòu)建α-synuclein原型基因能在大腸桿菌中高效表達的質(zhì)粒摘要α-synuclein蛋白在體內(nèi)異常折疊是帕金森病發(fā)生發(fā)展的重要原因，從α-synuclein來源的小分子多肽和分子伴侶DJ-1可以抑制α-synuclein的聚集。利用定向PCR技術(shù)體外擴增出GFP和α-synuclein原型的全長基因，將GFP重組到由PBR323改構(gòu)的V2載體中，得到重組體LG；然后以LG作為載體，以合成的9肽RGGAVVTGR為插入片斷進行亞克隆，得到LG9重組體；最后以LG9為載體，α-synuclein原型為目的基因，進行克隆。偶聯(lián)蛋白相互作用在細菌中的可視化技術(shù)，可以準確快速地用于鑒定α-synuclein蛋白在體內(nèi)的折疊變化，和作為快速有效地篩選大量突變體的經(jīng)濟簡便的方法。促進α-synuclein正確折疊的多肽的應用，將有希望能直接阻斷α-synuclein蛋白錯誤折疊的繼續(xù)產(chǎn)生，和阻斷甚至逆轉(zhuǎn)由異常聚集蛋白所造成的神經(jīng)損傷。(VisualizationoftheCoupledProteinFoldingandBindinginBacteria)關(guān)鍵詞：α-synucleinPD蛋白質(zhì)折疊GFP克隆AbstractAbstract:Theabnormalfoldingofα-synucleinistheimportantreasonforParkinsondiseaseinthebody.Thepeptideandchaperonescaninhibitα-synucleinaggregation.UsingdirectionPCRincreasethefull-lengthgeneofGFPandα-synuclein,insertGFPtotheV2plasmidwhichischangedfromPBR323andgetthecombinationLG,thenutilizethepeptide(RGGAVVTGR)asinserttorecombineLGtogetLG9.Coningthefull-lengthgeneofα-synucleintoLG9intheend.VisualizationoftheCoupledProteinFoldingandBindinginBacteriacannicetyandrapidlytoidentifytheabnormalfoldingchangesofα-synucleininthebody,andasasppendinessandavailablyeconomymethodtopickuptheabundanceofmutation.Thepeptidewhichcanimprovingtheα-synucleinaggregationmaybeinterdictabnormalfoldingofα-synucleindirectly，evenreversetheneuropathicdamnificationwhichleadbyproteinaggregation.keywords：α-synucleinPDproteinfoldingGFPclone1．前言 11.1帕金森疾?。≒D）簡介 11.1.1PD簡介 11.1.2PD研究史 11.1.3PD發(fā)病機理 21.1.4PD的治療方法 31.2α-synuclein與PD的研究 41.2.1α-synuclein的發(fā)現(xiàn) 41.2.2.α-synuclein的突變與家族性PD 51.2.3.α-synuclein的聚集 71.2.4．α-synuclein的聚集和解聚集的研究 81.2.5α-synuclein基因的功能，表達和調(diào)節(jié) 91.3.綠色熒光蛋白（GFP）與α-synuclein的研究 101.3.1綠色熒光蛋白（GFP） 101.3.2GFP與α-synuclein的關(guān)系 122.材料與方法 132.1．材料 132.1.1．實驗用基因 132.1.2．菌種 132.1.3．試劑 132.1.4酶及其緩沖液 132.1.5．主要儀器設備 132.2方法 142.2.1．緩沖液的配制 142.2.2實驗方案和路線： 152.2.3感受態(tài)細胞的制備 162.2.4目的基因的獲得 172.2.5質(zhì)粒載體的構(gòu)建 182.2.5.1LG質(zhì)粒載體的構(gòu)建 182.2.5.2．LG9質(zhì)粒載體的構(gòu)建 182.2.6LG9質(zhì)粒的提取和鑒定 182.2.7載體LG9和目的基因α-synuclein的雙酶切，鑒定和回收 192.2.8載體和目的基因連接 192.2.9重組體的電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 202.2.10轉(zhuǎn)化子的鑒定 203.結(jié)果與分析 223.1大腸桿菌的生長曲線 223.2.質(zhì)粒的制備 223.3目的基因的獲得v 233.4轉(zhuǎn)化 233.5鑒定結(jié)果 244.討論 244.1PCR條件的優(yōu)化 254.2外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應策略 254．3轉(zhuǎn)化 26參考文獻： 271．前言1.1帕金森疾?。≒D）簡介1.1.1PD簡介帕金森疾?。≒arkinson'sdisease，PD）是指一種多發(fā)生于中老年期的,緩慢進展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元變性死亡造成紋狀體DA含量下降,從而導致震顫、肌肉僵直、運動遲緩與體位不穩(wěn)等一系列綜合癥的疾病。根據(jù)聯(lián)合國的資料，目前全世界至少有400萬人患這種疾病。北美地區(qū)估計約有50-100萬名帕金森氏癥患者，每年約有5萬人診斷出患此癥。隨著全球老年人口增加，到了2040年，預計患帕金森氏癥的患者就會加倍。帕金森氏癥及其他常見的老年神經(jīng)退化性疾病，像是阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease,AD）與肌萎縮性側(cè)索硬化癥，正逐漸取代癌癥，成為頭號死因。帕金森氏癥的主要癥狀是運動障礙，包括手、臂與其他部位的震顫、肢體僵直、運動遲緩以及平衡協(xié)調(diào)障礙。這些障礙源自神經(jīng)元的死亡。受害細胞遍布整個大腦，但是黑質(zhì)（substantianigra）中能制造神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，受創(chuàng)最嚴重。這些多巴胺能神經(jīng)元是基底核（basalganglia）重要的組成成份；基底核負責機體微調(diào)與協(xié)調(diào)運動。黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元剛開始死亡時，腦子雖無法再生這些死掉的細胞，卻還可以正常運作。不過當這些特化細胞死亡的數(shù)目一旦過半，參與運動控制的腦區(qū)包括視丘、基底核與大腦皮質(zhì)等，無法協(xié)同運作，帕金森癥的癥狀就會開始出現(xiàn)，于是就發(fā)生運動失調(diào)。1.1.2PD研究史自從1817年，英國醫(yī)師JamesParkinson首次描述了一組以震顫、僵直、運動遲緩和步態(tài)失調(diào)伴姿勢不穩(wěn)為主要癥狀的神經(jīng)系統(tǒng)慢性進行性疾病以來，已經(jīng)過去了整整一個多世紀，人類一直沒有停止過對該病的研究和探索。1841年Hall將其稱之為“震顫麻痹”(shakingpalsy)，他對該病的癥狀進行了詳細描述。但隨著人們對該疾病的更多認識和了解，逐步認識到“震顫麻痹”的命名并不確切，因為，這類患者除了有肢體的不自主震顫、僵直和運動遲緩外，還有植物神經(jīng)功能紊亂等一些復雜癥狀伴隨，因此，1892年Charcot建議將這種疾病稱為帕金森?。≒arkinson’sdisease，PD）可能更能較全面的描述這一病癥，這一觀點也逐漸為大家所接受。雖然，人們在開始的時候已經(jīng)能診斷這種疾病，但還沒有治療的好辦法，值得一提的是，當神經(jīng)科學界還不十分清楚批PD的病因和發(fā)病機理時，我們神經(jīng)外科醫(yī)生的先驅(qū)們，為了解除大量病人的痛苦，很早在臨床就開始了手術(shù)治療帕金森病的大膽探索，盡管手術(shù)方法的發(fā)展緩慢而又帶有極大的危險性，正是有了這種臨床大量的成功與失敗的經(jīng)驗積累，才逐步豐富了對PD的認識，并逐漸改進和完善了更為有效的治療靶點和手術(shù)方法。Horsley早在1909年就報道了采用感覺運動皮層部分切除術(shù)治療PD，術(shù)后患者的肢體震顫明顯減輕，僅伴有中等度的功能障礙。直到上世紀的20年代，錐體外系在調(diào)節(jié)運動中的作用才被認識。當時許多神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生反對通過阻斷這些神經(jīng)傳導通路來治療PD，甚至連著名的神經(jīng)外科學的奠基人之一Dandy也認為毀損基底節(jié)的神經(jīng)傳導通路將是致命的。直到1939年，RussellMeyers通過開顱大腦半球中間入路基底節(jié)尾狀核毀損術(shù)，成功地治療帕金森病，才證明了Dandy的錯誤。隨著人們對PD發(fā)生機理越來越深刻的認識和科學技術(shù)的進步與飛躍發(fā)展，不僅發(fā)明了立體定向儀，而且隨著腦室造影、CT、MRI和術(shù)中微電極記錄等技術(shù)的應用，定向手術(shù)的靶點定位越來越準確，效果也越來越好，加之對帕金森病治療具有“神奇”效果的左旋多巴類藥物的出現(xiàn)，可以說，PD的治療取得了極大地成功。但是，盡管如此，到目前為止，對PD的治療還是治標不治本，仍然是不能徹底治愈病人達到根治的目的，無論是藥物還是手術(shù)治療仍然停留在減輕癥狀、提高生活質(zhì)量的狀況。隨著基因和干細胞移植等基礎神經(jīng)科學的研究進展，為徹底的治療PD帶來了希望。1.1.3PD發(fā)病機理PD的病因及發(fā)病機制至今尚不清楚。其病理特點是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易氏體(LB)。a-synuclein是LB的主要成分，a-synuclein的異常聚集對LB的形成具有一定的作用。2000年Trojanowski提出蛋白質(zhì)致死性聚集(fatalattraction)假說：正常腦蛋白之間的異常互相作用改變了正常蛋白的構(gòu)象，這些病理構(gòu)象異構(gòu)體積聚成細纖維，進而聚集成纖維多聚體。纖維狀的蛋白多聚體中往往有大量的j3結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)由于突變或其他原因引起構(gòu)象向j3折疊轉(zhuǎn)換是較普遍的轉(zhuǎn)換模式。這種構(gòu)象轉(zhuǎn)變致使正常蛋白的功能喪失，進一步積聚成的細纖維多聚體有神經(jīng)毒性特征。在淀粉樣纖維多聚體形成過程中，首先形成一種不甚穩(wěn)定的小分子a—synuclein寡聚體中間產(chǎn)物(中間體)，類似邶初纖維，隨后被處理變成更加穩(wěn)定的纖維多聚體，最后形成LBJ。a—synuclein一般有3種存在形式：單體、初纖維和纖維多聚體。生物物理學方法分析認為：初纖維(中間體)具有一個很大的表面積與體積之比，可能比其纖維樣終產(chǎn)物更具有毒性效應。與單體和纖維相比，初纖維(中間體)和突觸囊泡通過一個富有B折疊的結(jié)構(gòu)結(jié)合更加緊密，瞬間使這些囊泡的通透性增加，引起鈣離子涌人胞漿、線粒體膜去極化、多巴胺泄人胞漿，引起細胞死亡。此外，多巴胺還可通過氧化與a-synuclein供價結(jié)合，形成DA—a—synuclein內(nèi)聚體，抑制初纖維向纖維的轉(zhuǎn)變，使更具有毒性的初纖維含量升高?？寡趸瘎┚S生素E可逆轉(zhuǎn)這一過程[7l。人類a—synuclein的過度表達可升高活性氧(reacfiveoxidativespeciese)即ROS水平，降低細胞對氧化應激的閾值，增加多巴胺能細胞對多巴胺誘導的細胞死亡作用的易感性。a—synuclein通過NAC段與人類多巴胺轉(zhuǎn)運體(hDAT)的羧基末端直接結(jié)合形成一synuclein—hDAT復合物，便于DAT在膜上的叢集，借此加速對多巴胺的攝取和多巴胺誘導的細胞凋。多巴胺自身代謝可引起ROS產(chǎn)生(包括H202在內(nèi))，而且H202可進一步轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂卸拘缘牧u基。1.1.4PD的治療方法目前醫(yī)院治療PD的方針是以內(nèi)科為主，外科為輔。內(nèi)科治療是以藥物為主，主要藥物可分為以下幾類：一、增加腦中dopamine的含量，如左多鈀(Levodopa)：這一類的藥物也就是治療PD的主要藥物，如Sinemet(SinemetCR)、Madopar(MadoparHBS)等。二、直接刺激dopamine受體：這一類的藥物是輔助藥物，對於初期的PD病患可單獨使用或并用左多鈀藥物，如Bromocriptine、Lisuride、Pergolide、Apomorphine皮下注射針劑、Pramipexole、Ropinirole。三、減少dopamine被酵素分解：這一類藥物必需與左多鈀并用，不可單獨使用，如Tocapone、Entacapone。四、減少神經(jīng)接合點的dopamine損失,并促進腦的dopamine合成，如Amantadine、Remacemide。五、減少乙醯膽堿，以達到神經(jīng)傳導的平衡，如Trihexyphenidyl、Biperiden、Cogenein。六、另外藥物可能有保護神經(jīng)細胞的作用，如Selegiline。七、其他治療PD的并發(fā)癥，如Clozapine、Imipramine。外科治療方法主要是針對特定的PD，如嚴重顫抖癥或亂動癥，以及比較嚴重的患者，手術(shù)方法包括：一、立體定位手術(shù)，亦即采取燒灼的方式，燒灼的位置包括視丘、蒼白球及下視丘。二、腦胚胎移植，目前仍然被定在人體試驗階段。三、深部腦刺激，即在腦中植入一刺激電極，直接刺激視丘、蒼白球及下視丘。根據(jù)本動作障礙研究中心的經(jīng)驗，病人術(shù)後在停藥的狀態(tài)下，改善的程度可達七成。但是遺憾的是目前全世界研究人員與臨床人員都還找不到可以延緩、阻止或預防帕金森氏癥的方法。所有治療的方法都只能減緩癥狀，而不能拔除病根。不過近年來隨著分子生物學和諸項生物技術(shù)發(fā)展的進程，PD的研究也出現(xiàn)了曙光，特別是研究蛋白質(zhì)功能的研究人員，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)邪惡蛋白質(zhì)與帕金森氏癥的遺傳根源。這些發(fā)現(xiàn)，燃起了找尋治療新法的希望。1.2α-synuclein與PD的研究1.2.1α-synuclein的發(fā)現(xiàn)Synuclein最初是作為一種突觸前末梢蛋白于1988年由Maroteaux等從電鱘魚的帶電器官中首先分離出來的，基于它主要位于神經(jīng)突觸和細胞核膜上而被稱為Synuclein。至今，在不同的種系中已發(fā)現(xiàn)近200多種與Synuclein基因同源的DNA和蛋白質(zhì)，它們被分為三類：α-Synuclein，β-Synuclein和γ-Synuclein，它們的氨基酸序列高度保守，所有這些蛋白都有一個兩性結(jié)構(gòu)域，可以與脂質(zhì)雙層結(jié)合。α-Synuclein在神經(jīng)組織中廣泛表達，以新皮質(zhì)、海馬、嗅球、紋狀體和丘腦含量較高。但引起人們極大興趣的是α-Synuclein與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病關(guān)系的發(fā)現(xiàn)。1993年Ueda等在人類阿爾茨海默病淀粉樣斑塊中的非Aβ蛋白成分中分離到一種新的蛋白被命名為NAC，后來證實NAC的前體蛋白NACP就是α-Synuclein。由于主要在端腦成熟過程中表達，而認為它參與神經(jīng)元的可塑性并在記憶和學習中起作用。最近發(fā)現(xiàn)α-Synuclein基因的突變與家族性PD相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)它在多種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的Lewy體和膠質(zhì)細胞胞漿包涵體中均有高表達，多數(shù)學者認為它參與了神經(jīng)元的變性過程，提示它可能為此類疾病發(fā)生的分子橋梁而成為研究的熱點。1.2.2.α-synuclein的突變與家族性PD1996年P(guān)olymeropoulos等對1個源于意大利Contursi家族（常染色體顯性遺傳）進行家系連鎖分析，這個家系患者的臨床表現(xiàn)符合典型的帕金森癥，病理檢查發(fā)現(xiàn)lewy體，發(fā)病年齡相對較早，基因外顯率達85%，屬于單基因缺陷產(chǎn)生的PD臨床表型。將引起該家族性PD的相關(guān)基因定位在染色體4q21～23；通過基因重組技術(shù)發(fā)現(xiàn)α-Synuclein和PD基因定位相同，因此α-Synuclein基因被認為是PD致病的候選基因。后來對位于該區(qū)域的α-Synuclein基因的外顯子編碼序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，α-Synuclein基因有4個外顯子，發(fā)現(xiàn)在209位的鳥嘌呤變成了腺嘌呤，導致氨基酸序列53位的丙氨酸被蘇氨酸替代。除1例PD患者外，該家族的其余患者均為α-Synuclein基因第四號外顯子錯義突變（G209A，Ala53Thr）的雜合體。該種突變也在3個源于希臘的家族性PD中被發(fā)現(xiàn)，并且發(fā)病年齡也相對較早，但正常人未發(fā)現(xiàn)帶有該突變，提示該突變很可能是導致家族性PD的原因。Polymeropoulos認為，丙氨酸被蘇氨酸替換后，破壞了α-Synuclein的α螺旋，而易于形成β片層結(jié)構(gòu)，β折疊參與了蛋白質(zhì)的自身聚集并形成淀粉樣結(jié)構(gòu)。Feany等采用轉(zhuǎn)基因方法在果蠅身上表達野生型和突變型α-Synuclein，可觀察到發(fā)育至成年后，表達α-Synuclein突變型基因的果蠅表現(xiàn)出運動功能障礙，腦干多巴胺能神經(jīng)元丟失，神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)含α-Synuclein的絲狀包涵體。1998年Kruger等在研究192例散發(fā)性PD患者和7個家族性PD患者時，雖然他們未發(fā)現(xiàn)Ala53Thr突變，但在德國PD家系中發(fā)現(xiàn)4例患者的α-Synuclein基因的第三號外顯子中存在另1個不同突變（G80C，Ala30Pro），這一發(fā)現(xiàn)更加證實了α-Synuclein基因與家族性PD的關(guān)系。體外培養(yǎng)的人類BE-M17成神經(jīng)纖維瘤細胞經(jīng)轉(zhuǎn)導并過度表達野生型、A53T和A30Pα-Synuclein基因，發(fā)現(xiàn)在鐵和自由基刺激下，含α-Synuclein和ubiquitin的細胞產(chǎn)生胞漿內(nèi)聚集產(chǎn)物，聚集量與α-Synuclein基因表達的量和類型密切相關(guān)，依次是A53T>A30P>野生型>未轉(zhuǎn)染型。有研究報道證實，所有野生型和突變型α-Synuclein蛋白在體外孵育時都可形成不溶性的纖維聚集，而突變型蛋白聚集得更快，聚集形成時間分別為野生型蛋白280h，A30P突變180h，A53T突變100h。Bennett等的研究發(fā)現(xiàn)，野生型和A53T突變α-Synuclein蛋白均可被ubiquitin蛋白水解酶降解，但突變型比野生型α-Synuclein的半衰期長50%，從而為它在胞內(nèi)聚集提供了動力學基礎。表達人類野生型α-Synuclein的轉(zhuǎn)基因鼠的新皮質(zhì)、海馬和黑質(zhì)也有進行性的α-Synuclein聚集和神經(jīng)元內(nèi)ubiquitin免疫反應陽性包涵體。突變型α-Synuclein蛋白可能通過加速聚集及減緩降解，并也可能促進野生型蛋白的聚集而形成lewy體；而野生型α-Synuclein基因在某些情況下過度表達時也會產(chǎn)生聚集。Kruger等發(fā)現(xiàn)，在α-Synuclein基因啟動子區(qū)一個等位基因的多態(tài)性在PD患者和對照組之間差異顯著，而ApoE4等位基因啟動子多態(tài)性在早發(fā)性PD比遲發(fā)性明顯多見。根據(jù)ApoE4等位基因和α-Synuclein啟動子多態(tài)性等位基因1的組合在PD組和對照組的明顯不同，提示在散發(fā)性PD的病理發(fā)生中存在這些蛋白的相互作用，有這種基因型的人群發(fā)生PD的相對危險性增加了12.8倍。因此，α-Synuclein基因作為遺傳因素在PD發(fā)病中可能起關(guān)鍵作用。但是對散發(fā)或其它家族性PDα-Synuclein基因突變的研究均有一些陰性報道。Vaughan等利用腦組織提取DNA，對30例歐洲和美洲的高加索PD患者α-Synuclein基因所有7個外顯子進行擴增和直接測序，在所有的開放閱讀框架中未發(fā)現(xiàn)任何突變。陳彪等從24例確診為PD患者的腦組織中提取RNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得α-Synuclein基因，并對該基因的所有編碼序列進行測序，也未發(fā)現(xiàn)任何突變存在；此后他們又對100例早發(fā)性PD患者的DNA進行檢測，也未發(fā)現(xiàn)α-Synuclein基因G209A位點的錯義突變。Lin等報道中國臺灣地區(qū)的帕金森癥患者中亦未發(fā)現(xiàn)α-Synuclein基因的G209A和G88C兩類突變。Farrer等對家族性PD、多系統(tǒng)萎縮（MSA）及Lewy體癡呆患者進行了α-Synuclein基因第四外顯子測序分析，也未發(fā)現(xiàn)任何突變存在。Ozawa等分析了11例通過病理證實的尸檢MSA患者的大腦白質(zhì)和灰質(zhì)，在α-Synuclein基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)并未發(fā)現(xiàn)任何突變存在。Vaughan等就230例歐洲人種家族性PD進行G209A位點錯的檢測，亦無陽性發(fā)現(xiàn)。雖然不能排除在這一基因的其它操縱子或內(nèi)含子區(qū)域存在某些突變的可能，但上述研究結(jié)果提示，家族性PD中，發(fā)生的α-Synuclein基因突變是非常罕見的；α-Synuclein基因突變可能只與那些以發(fā)病年齡早、高外顯率、常染色體顯性遺傳為特征的家族性PD有關(guān)。盡管如此，研究和了解α-Synuclein引起多巴胺神經(jīng)元變性，對認識PD的發(fā)生機制有重大意義。1.2.3.α-synuclein的聚集Takeda等發(fā)現(xiàn)在lewy體相關(guān)的疾病的皮質(zhì)和皮質(zhì)下lewy體及軸突中都有NACP免疫反應，并且PD的黑質(zhì)和皮質(zhì)下lewy體顯示強陽性，ubiquitin和synaptophysin也呈陽性，但tau蛋白染色呈陰性。繼之有多篇研究報道發(fā)現(xiàn)α-Synuclein是多種神經(jīng)變性疾病中l(wèi)ewy體的主要成分，而Synuclein家族的另兩個成員在PD和lewy體癡呆的軸突損害病理機制中也起重要作用。下丘腦和腦干核團的神經(jīng)元核周絲亦有NACP陽性反應，染色陽性的核周絲由lewy體細絲或束組成，推測是lewy體形成的初級階段。體外實驗也發(fā)現(xiàn)，α-Synuclein蛋白可形成類似lewy體的細絲聚集。細胞內(nèi)lewy體是PD的特征性病理改變，因而推測α-Synuclein參與lewy體形成，參與了PD神經(jīng)元變性過程。目前對lewy體如何形成以及α-Synuclein在lewy體形成過程中如何發(fā)揮作用尚不清楚，主要有以下幾種解釋：1．α-Synuclein大量堆積形成lewy體的核心α-Synuclein是一種富含疏水性區(qū)域的天然伸展的蛋白質(zhì)，這些疏水區(qū)相互聚集并形成淀粉樣細絲，還可結(jié)合β淀粉蛋白并刺激其聚集，提示NACP可能自身聚集或與其他成分形成復合體。Jensen等發(fā)現(xiàn)，大約80%的皮層lewy體含有微管相關(guān)蛋白1B，它與NACP有重疊并且兩者有高度親和力，MAP-1B可與α-SynucleinC端最后45個氨基酸位點相結(jié)合。體外實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)MAP-1B與聚集的α-Synuclein纖維結(jié)合，提示MAP-1B可能通過與α-Synuclein單體和纖維的相互作用參與lewy體的形成。有一種稱為Synuclein-1的蛋白在體內(nèi)與α-Synuclein相互作用，轉(zhuǎn)染這些蛋白的HEK293細胞胞漿出現(xiàn)嗜酸性包涵體。C端切除的重組α-Synuclein易于聚集，形成類似于從PD患者腦分離的細絲，提示被蛋白酶水解后的肽段在病理過程中也起作用。α-Synuclein在某些情況下自身聚集，并與其他成分結(jié)合形成核心可能是lewy體形成的一種途徑。2．神經(jīng)元突觸蛋白的異常轉(zhuǎn)運NACP與其他突觸蛋白共同出現(xiàn)于lewy體內(nèi)，推斷突觸蛋白的異常轉(zhuǎn)運和NACP的異常分布在lewy體的形成中起作用。3．硝化或氧化作用人類重組α-Synuclein與硝化試劑接觸后形成硝化α-Synuclein寡聚體，該寡聚體進一步穩(wěn)定，形成不溶、耐熱的高分子多聚體。將重組α-Synuclein與細胞色素C/氫過氧化物共同孵育后，可見α-Synuclein聚集，這個過程可被抗氧化劑如N-乙酰-C-半胱氨酸所阻斷。氯高鐵血紅素/氫過氧化物也引起α-Synuclein的聚集，而且細胞色素C/氫過氧化物和氯高鐵血紅素/氫過氧化物引起的聚集可被鐵螯合劑（去鐵胺）部分抑制，表明由細胞色素C/氫過氧化物介導的鐵催化氧化反應很可能參與了促進α-Synuclein的聚集。雙標記研究顯示，細胞色素C與α-Synuclein在PD患者lewy體中共存。因此，認為氧化和硝化作用參與了lewy體的形成。4．金屬離子銅具有促使α-Synuclein形成自身寡聚體的作用，內(nèi)源性蛋白酶Asp-N切除α-Synuclein酸性C端后可抑制這種作用，因此認為銅引起的寡聚體依賴于α-Synuclein酸性C末端區(qū)域。二價鐵離子在有氫過氧化物存在時可促使NACP聚集。1.2.4．α-synuclein的聚集和解聚集的研究α-Synuclein積聚過程的靜態(tài)觀察實驗顯示，α-Synuclein的積聚過程主要包括下面幾個階段：1.沒積聚前α-Synuclein大部分是以單體的形式存在的，在圖像中為高度是0.3-0.5nm的球形顆粒；2.在37攝氏度搖床上溫浴9h后，蛋白已經(jīng)形成了大小不一寡聚體，寡聚體的高度在0.5-1.8nm范圍內(nèi)；3.在37攝氏度搖床上溫浴15h后，蛋白樣品中已經(jīng)出現(xiàn)了一些短纖維，這些短纖維的長度約為幾百nm；4.在37度搖床上溫浴48h后，蛋白溶液中已經(jīng)有長度在1微米以上的長纖維形成。α-Synuclein纖維解聚的原位觀察實驗結(jié)果顯示：在間斷掃描的情況下，經(jīng)過4h后，α-Synuclein纖維開始斷裂，隨著時間的延長，斷點不斷擴大且越來越多的蛋白顆粒出現(xiàn)在纖維周圍，在纖維上還會有其它的斷點出現(xiàn)。19h后，原來的蛋白長纖維已經(jīng)明顯解聚為短纖維和蛋白顆粒。從圖中可以發(fā)現(xiàn)蛋白纖維的解聚并不是在纖維的兩頭開始，而是在纖維的中間發(fā)生斷裂，然后不斷有蛋白寡聚體的顆粒從斷點的位置上解離下來，這樣斷裂的缺口慢慢擴大，在云母上也就有越來越多的從蛋白纖維上解聚下來的蛋白顆粒。在積聚過程中，蛋白單體先后形成寡聚顆粒、短纖維和長纖維，而當?shù)鞍诐舛冉档蜁r，蛋白纖維會自發(fā)地發(fā)生解聚，這種解聚并不是蛋白纖維由粗逐漸變細的過程，也不是纖維從兩端開始逐漸縮短的過程，而往往是在纖維的中間出現(xiàn)斷裂開始。這說明在長纖維的形成過程中，由于一些微觀因素的影響，導致纖維內(nèi)部一些亞單位的結(jié)合并不是很牢固（纖維內(nèi)部的亞單位可能是短纖維，也可能是蛋白寡聚顆粒，還有待于進一步的實驗研究），當?shù)鞍诐舛冉档停钟腥芤褐懈鞣N小分子的影響，時間一長，這些不牢固的相互作用就會被破壞，最終導致纖維的斷裂。所以觀察到的蛋白纖維的解聚并不一定是從纖維的兩端開始，而往往是在纖維中間開始。在溶液中各種小分子的作用下，蛋白纖維的亞基也會逐漸從纖維的兩端解離下來，由于實驗體系中蛋白濃度很低，遠遠低于它發(fā)生積聚時的濃度，所以解聚下來的蛋白也就很難再積聚起來。在實驗的最后觀察到長纖維已經(jīng)解聚。1.2.5α-synuclein基因的功能，表達和調(diào)節(jié)目前已經(jīng)清楚，α-Synuclein基因由6個外顯子和若干個內(nèi)含子組成；翻譯起始密碼ATG位于第二號外顯子，在第一號外顯子有2種不同的拼接位點，因此，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生2種含有不同5′端非翻譯序列的α-SynucleincDNA，翻譯產(chǎn)物為1個由140個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為19000蛋白。Maroteaux等發(fā)現(xiàn)，α-Synuclein僅僅在神經(jīng)組織中表達，而不在電親和性器官，如肌肉、肝、脾、心或腎中表達；α-Synuclein在新皮質(zhì)、海馬、嗅球、紋狀體、丘腦含量較高，腦干則含量較低；由于α-Synuclein主要分布在神經(jīng)細胞的突觸前膜，推測它與突觸前膜功能有關(guān)。Hsu等用RNA酶保護分析法、Westernblot和免疫組化等方法分析了胚胎、幼稚和成年小鼠腦組織的α-Synuclein和其它突觸蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)胚胎15d以后均有顯著增加，其中α-Synuclein增加的時間明顯偏早，提示這種蛋白對突觸發(fā)生及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展是重要的。George等研究發(fā)現(xiàn)，在斑雀等鳥學唱歌的過程中，α-Synuclein的同源蛋白賽尼芬（synelfin）在腦中的表達明顯增加，提示α-Synuclein可能與神經(jīng)元的可塑性相關(guān)。α-Synuclein基因的功能還不完全清楚，它的表達調(diào)控研究剛剛起步。Davidson等假定α-Synuclein與磷脂雙層的連接能夠穩(wěn)定這種蛋白α-螺旋的二級結(jié)構(gòu)，他們通過實驗發(fā)現(xiàn)那些包含了酸性磷脂的較小的林玫娜（unilamellar）磷脂囊泡，多與α-Synuclein相連，而且這種蛋白優(yōu)先與直徑20～25nm的囊泡連接，而不與直徑大于125nm的囊泡相連，這一蛋白與脂質(zhì)連接后伴隨著α-螺旋從3％增加到80％。Hashimoto等的實驗顯示在造血細胞系K562細胞中，當佛波酯誘導巨核細胞分化時，上調(diào)了α-Synuclein基因的表達，同時能下調(diào)β-Synuclein基因的表達；但在血小板中僅有α-Synuclein的豐富表達，提示α-Synuclein成員的協(xié)調(diào)表達在巨噬細胞分化中具有關(guān)鍵作用。而Kholodilov等發(fā)現(xiàn)下調(diào)α-Synuclein基因的表達與誘導神經(jīng)元凋亡并無相關(guān)。有關(guān)α-Synuclein的功能及其在PD致病機制中的作用目前仍有很多爭議，在其他神經(jīng)退化性疾病中也發(fā)現(xiàn)α-Synuclein的參與，因此研究α-Synuclein對于研究這些疾病的發(fā)病機理和治療手段無疑有著重要意義,也可以設想通過牽制α-Synuclein來達到控制疾病之目的。1.3.綠色熒光蛋白（GFP）與α-synuclein的研究1.3.1綠色熒光蛋白（GFP）GFP是從一種生活在北太平洋寒冷水域的水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。這種水母體內(nèi)含有一種生物發(fā)光蛋白質(zhì)——aequorin，它本身發(fā)藍光。GFP能把這種光轉(zhuǎn)變成綠色，也就是當水母容光煥發(fā)的時候我們實際看到的顏色。GFP的純?nèi)芤涸诘湫偷氖夜庀鲁庶S色，但是當被拿到戶外的陽光下時，它會發(fā)出鮮綠的顏色。這種蛋白質(zhì)從陽光中吸收紫外光，然后以能量較低的綠光形式發(fā)射出來。這是由于兩種蛋白的作用：鈣結(jié)合的發(fā)光蛋白aequorin和綠色的熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）。近10年中。GFP成了生化和分子生物學中最有趣的蛋白之一。除了為了解和利用蛋白結(jié)構(gòu)與光譜功能的關(guān)系，GFP已經(jīng)越來越成功的作為標記分子。用于研究從細菌到轉(zhuǎn)基因小鼠的基因表達和細胞內(nèi)過程。GFP發(fā)射光譜的峰值在508nm(Johnsonetal.1962).波長靠近活Aequorea組織的發(fā)射光譜。但是與純aequorin的化學發(fā)光距離較遠。它是藍色的。峰值靠近470nm。GFP最初純化和結(jié)晶的時候。發(fā)現(xiàn)當兩個蛋白共吸附在陽離子的支持物中。鈣激活的aequorin可以有效的把熒光能量轉(zhuǎn)移給GFP（Moriseetal.1974）。當能量以Foster類型機制從鈣激活的aequorin轉(zhuǎn)移給GFP時會發(fā)出綠光。激活的aequorin發(fā)出的藍光被含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)[4-（p-羥基苯亞甲基）咪唑啶-5-1]的六肽發(fā)射團（開始與GFP的64位殘基）捕獲，環(huán)狀結(jié)構(gòu)是通過位置1和位置2結(jié)合到肽骨架上。有趣的是，這種結(jié)構(gòu)像上一在所有的熒光蛋白中都保守，甚至那些來自于非生物發(fā)光生物發(fā)光生物體的熒光蛋白也是如此（Matzetal.1999）GFP的晶體結(jié)構(gòu)的解析為它被觀察到的許多物理性質(zhì)提供了解釋（Ormoeral.1996;Yangetal.1996）。該蛋白有一個β-桶狀結(jié)構(gòu)封裝一個為中心的α-螺旋構(gòu)成，β-桶狀結(jié)構(gòu)又由11條鏈（β片層）組成。殘基Ser-65,Tyr-66和GLY-67環(huán)成的發(fā)色團含在一個短的螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)，而螺旋結(jié)構(gòu)自身埋在緊密交織的11-鏈β-桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)（Ormoetal.1996;Yangetal.1996;Brejcetal.1997）。發(fā)色團隔絕在β“罐子”里賦予了GFP許多物理特性，包括抗尿素，去污劑，蛋白水解攻擊，熱變性以及在某些情況下進行甲醛固定。GFP的二，三級結(jié)構(gòu)為該蛋白的功能提出了一種機制。Head等（2000）報道了對來自Aequoreavictoria的aequorin的晶體結(jié)構(gòu)的解析，為鈣敏感發(fā)光蛋白的生物熒光機制提供了更進一步的細節(jié)。GFP在在Aequoria以外的生物提中仍然保留發(fā)出熒光的能力（Chalfieetal.1994）表明它的火星不需要抗體，輔因子或酶底物等其他介質(zhì)。這些早期極大成功的例子表明這種水母蛋白作為外源蛋白表達的潛在困難并非是不可克服的。盡管有這些實例，但是在野生型GFP的一些局限性可能會影響實驗設計。形成發(fā)色團以及把發(fā)色團封在β“罐子”的深處所需的翻譯后修飾會使GFP的合成與它能發(fā)出熒光之間有延遲（>1h）。這種延遲會使需要立即讀數(shù)的基因表達研究變得更復雜。GFP在較高等真核生物和植物中的有效表達可能需要優(yōu)化編程碼序列不能明確雨季某個特定的還有GFP的融合蛋白是否會產(chǎn)生有功能和發(fā)出熒光的蛋白。為了避免這個問題，應該建立和鑒定多種融合的構(gòu)建體。一般情況下，細胞中蛋白的過量表達會造成問題。例如酵母中GFP的高水平表達據(jù)猜測會使它在細胞中的定位發(fā)生錯誤。但是還不清楚這種結(jié)果是由于蛋白的過量還是蛋白的性質(zhì)造成的。對應于不同的蛋白濃度，離子強度和PH，GFP會有明顯的光譜變化。所以在標準條件下檢測GFP是很重要的。GFP標記分子最常作為標記物來追蹤融合伙伴分子的表達水平和定位，或作為檢測環(huán)境變化或蛋白相互作用的指標。在作為標記物的用途中，使用重組技術(shù)和突變技術(shù)產(chǎn)生的多個載體對融合蛋白的表達進行了優(yōu)化。這種載體通常使用熒光蛋白的“亮”類型，密碼子的利用針對特定細胞系進行了優(yōu)化（Zolotkinetal.1996）。這些構(gòu)建體的表達通常由巨細胞病毒啟動子等強的啟動子驅(qū)動。GFP的蛋白質(zhì)序列如下：MKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKG50

IDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQ100

LADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAA150

GITHGMDELYK161GFP作為標記物最成功的應用是監(jiān)測融合蛋白在活細胞和生物體中的動態(tài)定位和命運。尤其著的注意的是用一組GFP變異體能同時追蹤細胞不同蛋白的研究。結(jié)合隨機突變和定向突變研究，產(chǎn)生了變化的發(fā)色團結(jié)構(gòu)，使GFP可以作為細胞中環(huán)境變化或蛋白間或蛋白中相互作用的指示劑。1.3.2GFP與α-synuclein的關(guān)系將GFP和9肽（RGGAVVTGR）插入到載體中，并將α-synuclein插入到GFP基因前，讓這兩種蛋白偶聯(lián)表達，以此來確定這個特定的9肽是否能夠促進α-synuclein的正確折疊。研究證明GFP的發(fā)光亮度與α-synuclein蛋白的正確折疊和表達量成正比，利用蛋白偶聯(lián)表達技術(shù)，通過熒光微孔檢測儀檢測GFP的發(fā)光亮度，從而確定α-synuclein正確折疊和表達的含量。2.材料與方法2.1．材料2.1.1．實驗用基因由實驗室提供的GFP和α-synuclein的野生型基因，9肽（RGGAVVTGR）2.1.2．菌種E.coliDH5α和2566。2.1.3．試劑質(zhì)粒抽提和膠純化試劑盒購自上海申能博彩公司；苯酚；氯仿；95%乙醇；100%乙醇；tris；Hcl；EDTA，蔗糖，硼酸，溴酚藍，葡萄糖，冰醋酸，NaAc，酵母提取物，牛肉膏蛋白胨；氨芐青霉素，溶菌酶，西班牙瓊脂糖；PCR引物由上海Invitrogen公司產(chǎn)品合成。2.1.4酶及其緩沖液1、10×PCR反應緩沖液：500mmol/LKCl,100mmol/LTris·Cl,在25℃下,pH9.0,1.0％TritonX-100。

2、MgCl2：25mmol/L。

3、4種dNTP混合物：每種2.5mmol/L。

4、Taq/VentDNA聚合酶5U/μl。

5、T4DNA連接酶及連接緩沖液。

6、各種限制性內(nèi)切酶。

7、其它試劑：礦物油（石蠟油），1%瓊脂糖，5×TBE，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇和70％2.1.5．主要儀器設備美國奧豪斯電子天平,型號AR1140；上海安亭臺式低速離心機，型號TDL-40B，TGL-16C；重慶銀河電熱鼓風干燥箱，型號CS101-2AB；中科美菱低溫冰箱，型號DW-FW251；新飛電冰箱，型號BCD-248T；大龍醫(yī)療設備微量移液器，規(guī)格0.5-10ul，20-200ul，100-1000ul，1-5ml；格蘭仕微波爐，型號P7021TP-6；武漢科儀恒溫搖床，型號HQ-45Z；上海精宏電熱恒溫培養(yǎng)箱，型號DNP-9052；飛利浦攪拌機，型號HR7638/10/G；江蘇江門渦流混合器，型號QL-901；重慶銀河超級恒溫水浴鍋，型號CS501A；天津泰斯特超凈工作臺，型號CJ-2D；尤尼柯（上海）紫外可見分光光度計，型號UV-2000；上海駕鵬科技紫外分析儀，型號ZF1-11；上海醫(yī)用核子手提滅菌鍋，型號YXQ.SG41.280B；河南予華玻璃儀器氣流烘干器，型號800W；上海天能電泳儀，型號EPS300；北京六一電泳儀，型號DYY7C；北京六一水平電泳槽，型號DYCP-31B；上海天能水平電泳槽，型號HE120；上海天能雙垂直電泳槽，型號VE-180；北京六一小型雙垂直電泳槽，型號DYCZ-40D；北京六一迷你轉(zhuǎn)移電泳儀，型號DYCZ-40D；北京六一回旋式脫色搖床，型號WD-9405B；北京六一手體式紫外燈，型號WD-9403E；上海摩勒生物實驗用超純水機，型號Molgenral215a德國賽多利斯公司超級組合型超純水機，型號SartoriusArium611UV+UF；PE公司熒光/發(fā)光微孔板自動，型號WallacVICTOR3TM；美國伯樂公司PCR儀，型號MyCycelerTMThermalCycler；美國伯樂公司電穿孔微生物系統(tǒng)，型號MicroPulser。2.2方法2.2.1．緩沖液的配制1）．LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)：稱取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5,加去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。2）．LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉,高壓滅菌。3）．氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃4）．溶菌酶溶液：用10mmol/LTris?Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃5）．3mol/lNaAc(pH5.2)：50ml水中溶解40.81gNaAc?3H2O,用冰醋酸調(diào)pH至5.2,加水定容至100ml,分裝后高壓滅菌,儲存于4℃6）．溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃7）．溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋)，1％SDS。8）．溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高壓滅菌。溶液終濃度為:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。9）．TE緩沖液：10mmo/LTris?Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高壓滅菌后儲存于4℃10).STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris?Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)，5%TritonX-100。11).STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris?Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。12）．TBE緩沖液(5×)：稱取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。（2）上樣緩沖液(6×)：0.25%溴酚藍，40%(w/v)蔗糖水溶液。2.2.2實驗方案和路線：定向PCR獲取野生型GFP基因抽提V2質(zhì)粒載體，并進行電泳鑒定將質(zhì)粒載體V2和擴增基因產(chǎn)物GFP用（Xho1，Pst1）酶切，鑒定，回收連接，電轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5a鑒定，獲得陽性克隆，命名為LG提取LG質(zhì)粒為載體，（Pst1，Bam1）酶切，鑒定，回收以合成9肽（RGGAVVTGR）為插入片斷連接，電轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5a鑒定，獲得陽性克隆，命名為LG9抽提LG9質(zhì)粒為載體，并進行電泳鑒定定向PCR獲取α-synuclein的野生型基因?qū)①|(zhì)粒載體LG9和擴增基因產(chǎn)物α-synuclein用（Nde1，Xh01）酶酶切，鑒定，回收將載體和插入片斷連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中鑒定轉(zhuǎn)化子酶切鑒定PCR鑒定獲得陽性克隆體2.2.3感受態(tài)細胞的制備使用氯化鈣法制備感受態(tài)細胞。2.2.3.1．大腸桿菌DH-5α挑取大腸桿菌DH-5α和2566單菌落接種于50ml三角瓶中，37℃，200rpm,過夜培養(yǎng)14-16h后，然后接種3%至另一三角瓶中，37℃，200rpm培養(yǎng),于30min,60min,80min,90min,100min,110min,120min,140min,160min后，在600nm處測其OD600值。以時間為橫坐標，OD600為縱坐標，作大腸桿菌DH52.2.3.2．大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞的制備1．受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α/2566單菌落,接種于10mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長中期。將該菌懸液以3%接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD2．感受態(tài)細胞的制備將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置30分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。棄去上清,用預冷的0.1mol/L的CaCl2溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細胞懸液。感受態(tài)細胞分裝成200μl的小份,貯存于2.2.4目的基因的獲得采用定向PCR擴增目的基因：對GFP和α-synuclein擴增是用有3’—5’糾錯能力的高溫DNA聚合酶（VentDNAPolymerase)，高保真的對GFP和α2.2.4.1PCR擴增α選擇野生型GFP和α-synuclein基因作為特異選擇性PCR的模板，選擇Vent酶作為PCR反應的DNA合成酶。依次混勻下列試劑：35μlH2O、5μl10×PCR反應緩沖液、4μl25mmol/LMgCl2、4μl4種dNTP，上下引物各0.5μl（GFP引物為38和39；α-synuclein引物為96和109）1.0μl野生型α-synuclein或GFP基因、混勻后離心5秒。在95℃預變性10min，隨后在4℃下加入10×Buffer,dNTP,水和Vent酶，接著進入PCR循環(huán)：95℃變性1min后進入58.9℃退火90s,72℃,90s96:5>GGTCATATGGATGTATTCATGAAAGGACT>3109:5>AAACTGCAGTTACTCAATGGTGATGGTGA>3隨后停止反應，向反應液中加入5μl的LoadingBuffer終止反應。瓊脂糖電泳鑒定。2.2.4從上述每個PCR反應管中取5μl的溶液，用濃度為0.8%鑒定瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓80v，用凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察，如看到一條與DNAMarker700（GFP和α-synuclein都為700bp）相平行的橘黃色條帶出現(xiàn)，證明結(jié)果為陽性，否則為陰性。2.2.4.3目的基因的回收取2.2.4.2中剩余溶液,用微量移液槍小心加入樣品槽中，合上電泳槽蓋,接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳。在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。在手提式紫外燈的照射下，將目的DNA條帶切下用3sSpinAgrosepurificationKit試劑盒回收DNAα-synuclein和GFP基因。最后用120μl無菌水溶出目的DNA基因放入-20℃將回收膠稱重，加入4倍體積的SolutionSN，置于65℃水浴中5分鐘，中間混勻幾次，至膠完全融化。等膠融化后再加入1倍體積的SB混勻。將3S柱放入2ml倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一個收集管中，高速離心（10,000rpm）２分鐘。將3S柱放入一根新的1.5ml離心管中，在3S柱膜中央加30μlTE或水，不要蓋上離心管蓋，室溫或37℃放置2分鐘。蓋上離心管蓋，10,000rpm高速離心1分鐘，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃?zhèn)溆谩?.2.5質(zhì)粒載體的構(gòu)建從V2菌種抽提V2質(zhì)粒載體，將V2和GFP基因分別用Xho1和Pst1酶切后連接，構(gòu)建LG重組載體；然后以LG為載體，以9肽（RGGAVVTGR）為插入片斷，進行亞克隆，得到重組質(zhì)粒載體LG9。2.2.5.1LG質(zhì)粒載體的構(gòu)建用定向PCR擴增出GFP基因，回收，純化。用3sSpinplasmidpurificationKit提純V2載體，同時用Xho1，Pst1酶切，回收，連接，轉(zhuǎn)化。鑒定為陽性克隆，命名為LG。2.2.5.2．LG9質(zhì)粒載體的構(gòu)建用3sSpinplasmidpurificationKit提純LG載體，用Pst1，Bam1酶切），回收，以化學合成好的9肽（RGGAVVTGR）為插入片斷，直接連接，電擊轉(zhuǎn)化。鑒定為陽性克隆，命名為LG9。2.2.6LG9質(zhì)粒的提取和鑒定按照3sSpinplasmidpurificationKit提供的方法進行質(zhì)粒提取，純化和回收目的DNA。集菌1.5ml菌液于離心管中，離心12，000rpm，1min，加200ul含RnaseA1的P1，振蕩至徹底懸浮。加200ulP2，迅速溫和顛倒數(shù)次，混勻。加200ulP3，迅速溫和顛倒數(shù)次，然后室溫下靜置2min；離心12，000rpm，1min。移上清至離心吸附柱中，離心10，000rpm，30s，棄下清。加500ulW1，離心10，000rpm，30s，棄下清。加500ulW2，離心10，000rpm，30s，棄下清，同前再洗一次。加500ulW2，離心12，000rpm，1min，棄凈W2。取出離心吸附柱置于1.5ml離心管中，加50ulEluentBuffer。室溫下靜置2min，離心12，000rpm，1min。棄離心吸附柱，含有所提取質(zhì)粒的1.5ml離心管于-20度保存。取質(zhì)粒DNA溶液7μl加入loadingbuffer1μl用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳膠用凝膠成像系統(tǒng)觀察是否有0.7kb的片段。2.2.7載體LG9和目的基因α-synuclein的雙酶切，鑒定和回收2.2.7.1載體和目的基因的雙酶切，鑒定載體雙酶切目的基因雙酶切DNA：60μlDNA：100μl10×Buffer：8μl10×Buffer：12μlE1：2μlE1：2μlE2：2μlE2：2μlH2O（滅菌）：8μlH2O（滅菌）：4μl總計：80μl總計：120μl將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號,按上表分別加入eppendorf管中,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底?；靹蚍磻w系后,將eppendorf管置于適當?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37℃水浴大約保溫3小時,使酶切反應完全后，加入1/10體積的上樣buffer，取5μl反應液，用0.8%的瓊脂糖電泳鑒定2.2.7.2酶切產(chǎn)物的回收方法同前2.2.4.3。將目的片段在紫外燈下，切膠回收。用3sSpinAgrosepurificationKit試劑盒回收酶切完的LG9質(zhì)粒和α-synuclein基因。2.2.8載體和目的基因連接取新的經(jīng)滅菌處理的0.5mleppendorf管,編號。將0.1μg載體DNA轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA片段。于45℃保溫5分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。加入10×T4DNAligasebuffer2μl,T4DNAligase1μl,混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底,于LG9載體：14ul（0.1μg）α-synuclein基因：3ul10×Buffer：2ulT4ligase：1ul共20ul體系同時做二組對照反應，其中對照組一只有質(zhì)粒載體無外源DNA；對照組二只有外源DNA片段沒有質(zhì)粒載體。2.2.9重組體的電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化將DNA連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞中，混勻。置于冰上30～60S。將感受態(tài)細胞與DNA連接產(chǎn)物混合物加至預冷的電轉(zhuǎn)杯中，輕擊液體以確保感受態(tài)細胞與DNA連接產(chǎn)物懸液位于電轉(zhuǎn)杯底部。擦干電轉(zhuǎn)杯外的冷凝水和霧氣，將電轉(zhuǎn)杯放進電轉(zhuǎn)儀。調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)儀：2mm的電轉(zhuǎn)杯使用2500V按上述設定參數(shù)，啟動電脈沖。脈沖結(jié)束后，盡可能快的取出電轉(zhuǎn)杯，加入0.8ml37℃預熱的SOC培養(yǎng)基。將細胞轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，于37℃同時做兩個對照:對照組1:以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現(xiàn)。對照組2:以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產(chǎn)生大量菌落。2.2.10轉(zhuǎn)化子的鑒定1）、酶切鑒定用連接反應中相應的酶切連接產(chǎn)物，然后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如果切出的DNA是連接載體和插入片斷的大小，連接為陽性，否則為陰性。反應體系(20ul)：質(zhì)粒DNA：10ul10×Buffer：2ul100×BSA：0.2ulE:1+1ul2）、PCR鑒定用插入片斷引物，連接產(chǎn)物為模版，PCR擴增。用DNA電泳鑒定。有插入片斷為陽性，否則為陰性。反應體系（50ul）：Primer:2.5+2.5ulTemplate:1ulH2O:19ul在95℃變性10min后，降溫至10×Buffer：5ulVent：1uldNTP:1ulH2O:18ul在95℃預變性10min，隨后在4℃下加入10×Buffer,dNTP,水和Vent酶，接著進入PCR循環(huán)：95℃變性1min后進入58.9℃退火90s,72℃,90s隨后停止反應，向反應液中加入5μl的LoadingBuffer終止反應。瓊脂糖電泳鑒定。α-synuclein和GFP都在0.7kb處有明顯亮帶出現(xiàn)。2.2.11計算轉(zhuǎn)化率[12]如果證明了菌落是陽性重組體，則統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應原液總體積／涂板菌液體積轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每μg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(μg)感受態(tài)細胞總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細胞總數(shù)3.結(jié)果與分析3.1大腸桿菌的生長曲線以時間為橫坐標，OD600為縱坐標，作大腸桿菌DH5α的生長曲線。時間20406080100120140160180OD6000.010.020.070.240.380.450.700.921.23.2.質(zhì)粒的制備經(jīng)試劑盒提取純化的質(zhì)粒，在含EB的瓊脂糖凝膠上檢測，純化的質(zhì)粒為單條帶，且不含RNA。結(jié)果如下圖：6.5kb4000bp3000bp1000bp700bp500bp300bp100bp１＆２＆３由Ｖ２提取純化的plasmid（效果很好）４由Ｖ２提取純化的plasmidMTakaraDNAMarkerDL20003.3目的基因的獲得vGFP以38和39分別作為上下端引物，擴增出0.7kb的GFP基因。α-Synuclein原型以96和109分別為上下端引物擴增出0.7kb的α-Synuclein原型的全長基因。PCR1:0.7kb的GFP基因PCR2:0.7kb的α-Synuclein原型的全長基因。MARK:從下向上分別為：100bp,300bp,500bp,750bp,1000bp,3000bp,4000bp.3.4轉(zhuǎn)化在連接前，通過瓊脂糖凝膠電泳明顯可見目的基因和載體。Ｖ：載體Ｉ：目的基因通過電擊轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化GFP-V2重組體，在有Ampr的培養(yǎng)基上有12個單菌落長出，命名為LG；再次進行亞克隆LG9肽，在有Ampr的培養(yǎng)基上有8個單菌落長出。最后電擊轉(zhuǎn)化，在有Ampr的培養(yǎng)基上有100個LG9-α-Syn原型單菌落長出3.5鑒定結(jié)果從轉(zhuǎn)化平板上挑取的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒抽提和雙酶切電泳鑒定后，確定為所要的重組質(zhì)粒。即用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后電泳，得到2條帶，一條約0.7Kb，一條約6.5Kb.另將抽提的質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，可明顯觀察到擴增出一條0.7Kb的片段，同插入片斷相符，證明重組成功。電泳結(jié)果見圖（1）酶切鑒定：1．質(zhì)粒用Nde1和Xho1雙酶切后，有0.7kb基因2．未經(jīng)酶切的質(zhì)粒（對照）M.從下向上分別為：100bp,300bp,500bp,700bp,1000bp,3000bp,4000bp.PCR鑒定：經(jīng)PCR擴增出的α-Synuclein原型的全長基因。M.從下向上分別為：100bp,300bp,酶切鑒定PCR鑒定500bp,700bp,1000bp,3000bp,4000bp.3.6計算轉(zhuǎn)化率經(jīng)過陽性鑒定，確定生長的菌體是陽性體，但是整個轉(zhuǎn)化平板有100個單菌落。所以通過上述的公式計算得到：轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝100×100×8/100＝800轉(zhuǎn)化頻率＝800/1×10-3μg＝0.8×108感受態(tài)細胞總數(shù)＝1000×10×5＝50000感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率＝800/50000＝1.6%電擊轉(zhuǎn)化效率達到0.8×108，滿足轉(zhuǎn)化要求。4.討論4.1PCR條件的優(yōu)化在整個實驗的所有PCR中，原料均采用分步添加的方法。即先將template和primers先在95℃變性10min后，然后在4℃下，再加入vent,dNTP，buffer和適量無菌水。這樣有利于template和primers里面的少量蛋白質(zhì)提前變性，減少非特異性擴增，提高PCR的效率。4.2外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應策略1、帶有非互補突出端的片段：用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進行消化可以產(chǎn)生帶有非互補的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴增時，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。2、帶有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物,而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細調(diào)整連接反應中兩種DNA的濃度,以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉,最大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連,產(chǎn)生一個帶有兩個缺口的開環(huán)分子,在轉(zhuǎn)入E.coli受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復。3、帶有平末端是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或