限制酶酶切位點的選擇限制酶的選擇：尤其是同尾酶相關(guān)的題目；2021-山東卷-25T典型例題-1BamHⅠ：G↓GATCCEcoRⅠ：C↓AATTCHindⅡ：GTY↓RACKpnⅠ：GGTAC↓CSau3AⅠ：↓GATCSmaⅠ：CCC↓GGGMunⅠ：C↓AATTGXhoⅠ：C↓TCGAGSalⅠ：G↓TCGAC產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶（同尾酶）？背景知識背景知識編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子背景知識拓展思考：鐮狀細(xì)胞貧血癥的基因治療策略方向一：通過基因編輯破壞病人的造血干細(xì)胞中BCL11A基因的增強子，下調(diào)BCL11A基因的轉(zhuǎn)錄；參考論文：“CRISPR–Cas9-mediatedgeneeditingoftheBCL11Aenhancerforpediatricβ0/β0transfusion-dependentβ-thalassemia”方向二：使用CRISPR?Cas9技術(shù),對造血干細(xì)胞的BCL11A基因進(jìn)行靶向切割,使得BCL11A基因表達(dá)量下降,從而使胎兒血紅蛋白表達(dá)量提高,有望作為地中海貧血和鐮刀型貧血癥治療的新手段。方向三：通過基因工程向病人的造血干細(xì)胞中導(dǎo)入BCL11A的反義基因，通過RNAi下調(diào)BCL11A基因的轉(zhuǎn)錄；方向四：通過基因編輯，破壞病人的造血干細(xì)胞中γ-基因中的能與BCL11A蛋白結(jié)合的序列，直接上調(diào)γ-基因轉(zhuǎn)錄。方向五：通過基因工程，把正常的β-珠蛋白基因?qū)氩∪说脑煅杉?xì)胞內(nèi)。Zynteglo是一種一次性基因療法，開發(fā)用于治療SCD和β-地中海貧血。Zynteglo將改良版本的β珠蛋白基因（βA-T87Q-珠蛋白基因）的功能拷貝添加到患者自身的造血干細(xì)胞（HSC）中。一旦回輸體內(nèi)后，患者就擁有了βA-T87Q-珠蛋白基因，其紅細(xì)胞就能夠產(chǎn)生抗鐮狀血紅蛋白HbAT87Q，降低HbS的比例，從而減少鐮狀紅血球、溶血等并發(fā)癥。癌癥CAR-T治療變式訓(xùn)練綠-268-14T用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點如圖所示。（1）常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中_____酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中____酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是_________。變式訓(xùn)練（3）DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能___________；質(zhì)粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因（如某種抗生素抗性基因），利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是______________。（4）表達(dá)載體含有啟動子，啟動子是指__________________。變式訓(xùn)練答案Sau3AⅠ兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端甲、丙甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄T4DNA連接酶變式訓(xùn)練2021-全國乙卷-38T2021-天津卷-16T(2)綠-264-2T綠-271-2T綠-272-2T綠-259-6T(2)(3)拓展思考：兩個融合基因之間的限制酶序列限制酶切質(zhì)粒DNA連接酶連接重組質(zhì)粒某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。（1）為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計引物，通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是_______、為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應(yīng)添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。典型例題-2（2）PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是______。修改擴(kuò)增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是______。答案（1）①兩種引物分別與兩條模板鏈3'端的堿基序列互補配對

②5'端（2）①在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中，限制酶識別序列對應(yīng)的最后兩個堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個堿基構(gòu)成一個密碼子，導(dǎo)致讀碼框改變，翻譯出的氨基酸序列改變。

②在EcoRI識別序列前后增加堿基，使其堿基數(shù)日加上FLAG的堿基數(shù)口為3的倍數(shù)Ⅰ型糖尿病是因免疫系統(tǒng)將自身胰島素作為抗原識別而引起的自身免疫病。小腸黏膜長期少量吸收胰島素抗原，能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)識別該抗原后應(yīng)答減弱，從而緩解癥狀。科研人員利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠進(jìn)行動物實驗，使乳酸菌在小鼠腸道內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生人胰島素抗原，為此構(gòu)建重組表達(dá)載體，技術(shù)路線如下。（1）為使人胰島素在乳酸菌中高效表達(dá)，需改造其編碼序列。下圖是改造前后人胰島素B鏈編碼序列的起始30個核苷酸序列。據(jù)圖分析，轉(zhuǎn)錄形成的mRNA中，該段序列所對應(yīng)的片段內(nèi)存在堿基替換的密碼子數(shù)有________個。（2）在人胰島素A、B肽鏈編碼序列間引入一段短肽編碼序列，確保等比例表達(dá)A、B肽鏈。下列有關(guān)分析正確的是________。A．引入短肽編碼序列不能含終止子序列B．引入短肽編碼序列不能含終止密碼子編碼序列C．引入短肽不能改變A鏈氨基酸序列D．引入短肽不能改變原人胰島素抗原性（3）在重組表達(dá)載體中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶僅有圖示的酶切位點。用這兩種酶充分酶切重組表達(dá)載體，可形成________種DNA片段。（4）檢測轉(zhuǎn)化的乳酸菌發(fā)現(xiàn)，信號肽-重組人胰島素分布在細(xì)胞壁上。由此推測，信號肽的合成和運輸所經(jīng)歷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)依次是________________________________。（5）用轉(zhuǎn)化的乳酸菌飼喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段時間后，小鼠體內(nèi)出現(xiàn)人胰島素抗原，能夠特異性識別它的免疫細(xì)胞有________。A．B細(xì)胞B．T細(xì)胞C．吞噬細(xì)胞D．漿細(xì)胞答案(1).6(2).ABCD(3).3(4).核糖體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁(5).AB某種熒光蛋白（GFP）在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。某科研團(tuán)隊將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1-GFP融合基因（簡稱為甲），并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達(dá)載體P1，其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點的示意圖如下，圖中E1~E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。（1）據(jù)圖推斷，該團(tuán)隊在將甲插入質(zhì)粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是_________。使用這兩種酶進(jìn)行酶切是為了保證______，也是為了保證_________。（2）將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細(xì)胞后，若在該細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細(xì)胞中完成了________和_________過程?！敬鸢浮浚?）E1和E4甲的完整甲與載體正確連接（2）轉(zhuǎn)錄翻譯（3）細(xì)胞核去核卵母細(xì)胞（4）核DNA目的基因是導(dǎo)入乳腺細(xì)胞中嗎？目的基因僅存在于子代的乳腺細(xì)胞中嗎？培育乳腺生物反應(yīng)器時為什么選用乳腺細(xì)胞中特異表達(dá)的基因的啟動子？目的基因除了在乳腺細(xì)胞中表達(dá)外，會在肌肉細(xì)胞中表達(dá)嗎？為什么？拓展思考拓展思考組成型啟動子：每種細(xì)胞中均發(fā)揮作用組織特異型啟動子：特定細(xì)胞中發(fā)揮作用誘導(dǎo)型啟動子：特定條件刺激下發(fā)揮作用針對訓(xùn)練：綠-259-6TW是一種具有特定功能的人體蛋白質(zhì)。某研究小組擬仿照制備乳腺生物反應(yīng)器的研究思路，制備一種膀胱生物反應(yīng)器來獲得W，基本過程如圖所示。（1）步驟①中需要使用的工具酶有________。步驟②和③所代表的操作分別是____和_____。步驟④稱為__________。典型例題-3W是一種具有特定功能的人體蛋白質(zhì)。某研究小組擬仿照制備乳腺生物反應(yīng)器的研究思路，制備一種膀胱生物反應(yīng)器來獲得W，基本過程如圖所示。（1）步驟①中需要使用的工具酶有________。步驟②和③所代表的操作分別是____和_____。步驟④稱為__________。（2）與乳腺生物反應(yīng)器相比，用膀胱生物反應(yīng)器生產(chǎn)W的優(yōu)勢在于不受轉(zhuǎn)基因動物的__（答出2點即可）的限制。（3）一般來說，在同一動物個體中，乳腺上皮細(xì)胞與膀胱上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中染色體DNA所含的遺傳信息________________（填相同或不同），原因是____