醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)三（一）免疫標(biāo)記技術(shù)

1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（雙抗體夾心法）

2、斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)（二）免疫細(xì)胞的分離與純化

1.密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（含淋巴細(xì)胞）（三）免疫細(xì)胞功能測(cè)定

1、E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)（示教）

2、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（示教）（四）結(jié)核病相關(guān)的免疫試驗(yàn)簡(jiǎn)介（一）1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

待檢標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)品稀釋孔

陰性對(duì)照“ELISA雙抗體夾心法”，第5步，加待檢標(biāo)本、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照各2孔，每孔100ul，37℃，30分鐘：

（一）免疫標(biāo)記技術(shù)【概念或原理】：利用熒光素、酶、膠體金、發(fā)光物質(zhì)以及放射性核素等易顯示物（標(biāo)記物）連接于已知抗體或抗原，再去檢測(cè)待測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗原或抗體的量或其存在與否?！痉诸悺?/p>

熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)→ELISA（雙抗體夾心法

）放射免疫技術(shù)金免疫技術(shù)→斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)等

Ag＋Ab

熒光素Ag－Ab－熒光素＋Ab

熒光素（？）＋Ab－熒光素（洗滌）免疫標(biāo)記技術(shù)舉例：（細(xì)胞表面可見熒光）6cellswithfluorescencetuberclebacilluswithfluorescence8酶免疫技術(shù)酶免疫組化技術(shù)：組織或細(xì)胞中抗原定位酶免疫測(cè)定(如ELISA)：測(cè)液體標(biāo)本中抗原或抗體ELISA

(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，enzyme-linkedimmunosorbentassay)

sandwichELISAtodetectAg√indirectELISAtodetectAb

competitiveELISAtodetectAborAg

1）已知抗體包被

2）洗板

3）加待檢抗原標(biāo)本

4）洗板

5）加酶標(biāo)記抗體

6）洗板

7）加底物顯色，測(cè)定

(measurecolor)

10（顯色）（不顯色）（定量）(noAg

)

(Ag

)polystyreneSandwichELISA(todetectAg,雙抗體夾心法，原理)（封閉的意義）（一）免疫標(biāo)記技術(shù)

1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

------雙抗體夾心法請(qǐng)按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)講義方法進(jìn)行操作，第5-9步；第5、7步孵育時(shí)間由60min改為30min；結(jié)果肉眼判斷第5步按下頁P(yáng)PT的圖加樣，加6個(gè)孔，37℃，30分鐘，（實(shí)驗(yàn)課開始時(shí)已做，接著做第6步，洗板）（一）1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

待檢標(biāo)本陽性對(duì)照陰性對(duì)照“ELISA雙抗體夾心法”，第5步，加待檢標(biāo)本、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照各2孔，每孔100ul，37℃，30分鐘：13(IndirectELISAtodetectAb)14（一）2、斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)

(dotgoldimmunochromatographicassay，DICA)the"rapidtests"thatyoumightusetodetectpregnancy,ordiagnoseaninfectionquicklyinadoctor'soffice.16BCTRA(Nitrocellulosemembrane)金標(biāo)抗體（免疫金復(fù)合物）（小鼠IgG）（抗HCG）特異性抗原（HCG，絨毛膜促性腺激素）固相特異性抗體（抗HCG）固相抗小鼠IgG抗體

陽性：T區(qū)、R（或C）區(qū)均出現(xiàn)紅色線條（兩條紅線）；陰性：T區(qū)不出現(xiàn)紅色線條，僅R（或C）區(qū)出現(xiàn)紅色線條（一條紅線）。1718

positivenegativeinvalid斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)請(qǐng)按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)講義方法進(jìn)行操作，并判斷結(jié)果

（二）免疫細(xì)胞的分離與純化

1.

密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（含淋巴細(xì)胞）（二）1.外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離

密度梯度離心法[原理]1）人外周血中紅細(xì)胞、粒細(xì)胞密度1.092左右，單個(gè)核細(xì)胞為1.075~1.090。根據(jù)各類血細(xì)胞比重的差異，分離得到單個(gè)核細(xì)胞。2）外周血單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，可進(jìn)一步分離得到淋巴細(xì)胞。

離心前離心后抗凝血分離液血漿層單個(gè)核細(xì)胞層分離液紅細(xì)胞、粒細(xì)胞（白色云霧狀，薄層）Mainmethod:AnticoagulatedbloodarelayeredonthetopofFicoll(lymphocyteseparationmedium),horizontalcentrifugation,Fourlayers:plasma,lymphocytes,Ficoll,granulocytesandredbloodcells;(figure)Collectlymphocytes.23[方法]1.每桌（4人，2組）準(zhǔn)備抗凝血1份（約4ml）；（已做，用前混勻）2.將分層液（淋巴細(xì)胞分離液）加入試管（已做）3.每組用吸管吸取肝素抗凝血約2ml緩慢加在淋巴細(xì)胞分離液之上（沿試管壁緩慢加入）；4.水平離心(2000rpm,20min)；[方法]5.將吸管輕插至淋巴細(xì)胞層，沿試管壁周緣輕輕吸取上下液界面間的單個(gè)核細(xì)胞層，置另一干凈試管內(nèi)；6.洗滌單個(gè)核細(xì)胞2次(加入約1mlHanks’液,混勻，離心，1500或2000rpm，5min，倒去上清；重復(fù)1次)；7.用殘留上清(或加Hanks’液約0.1ml)重懸獲得的單個(gè)核細(xì)胞，備用；8.吸取單個(gè)核細(xì)胞混懸液，加一滴于載玻片上，顯微鏡下觀察單個(gè)核細(xì)胞（以淋巴細(xì)胞為主）Lymphocytes(淋巴細(xì)胞)Lymphocytes淋巴細(xì)胞normal

smalllymphocyteinbloodsmear(血片中淋巴細(xì)胞)lymphocyte

（三）免疫細(xì)胞功能測(cè)定

1、E花環(huán)試驗(yàn)

原理：T細(xì)胞表面有綿羊紅細(xì)胞受體（E受體）(CD2)，若T細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞共同孵育，T細(xì)胞周圍吸附綿羊紅細(xì)胞，為花環(huán)形成細(xì)胞，

可用來鑒定和計(jì)數(shù)T細(xì)胞

＋＋T細(xì)胞SRBC花環(huán)形成細(xì)胞B細(xì)胞SRBC＋（60～80％）CD2

E花環(huán)形成率=

形成E花環(huán)細(xì)胞數(shù)形成E花環(huán)細(xì)胞數(shù)+未形成花環(huán)細(xì)胞數(shù)×100%總E花形成率：60~80%活性E花形成率：25~40%rosetteforming

cellT

cell

顯微鏡下觀察花環(huán)形成細(xì)胞，310室，不要求計(jì)算E花環(huán)形成率。

（三）2、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)PHAT淋巴細(xì)胞（小細(xì)胞）淋巴母細(xì)胞

Tcell

lymphoblast(smallcell)(largecell)

BcellrestingBcell(smallcell)(Untransformed

lymphocytes)(transformedlymphocytes)(轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞)(未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞)PHAPHA

轉(zhuǎn)化率=

轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)+未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)×100%TcellsTcells+Bcells×100%（60~80%）核分裂相細(xì)胞過渡型細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞包括以下三種細(xì)胞：（1）淋巴母細(xì)胞：體積明顯增大，為成熟淋巴細(xì)胞的3～4倍。核膜清晰，核染色質(zhì)疏松，呈細(xì)網(wǎng)狀。核內(nèi)見明顯核仁1～4。胞漿豐富，嗜堿性，有偽足樣突出。胞漿內(nèi)有時(shí)可見小空泡。（2）過渡型淋巴細(xì)胞：具有上述淋巴母細(xì)胞的某些特征。核質(zhì)疏松，可見核仁，胞漿增多，嗜堿性強(qiáng)。體積比小淋巴細(xì)胞大。（3）核分裂相細(xì)胞：核呈有絲分裂，可見許多對(duì)成堆或散在的染色體。

Lymphoblast(typical,morphologicalfeatures):Lymphoblastsare12-20μmindiameterwitharoundtoovalnucleus,sometimeseccentricinlocation.Thenucleustocytoplasmratioisabout4:1andtheperipheryofboththenucleusandthecellmaybeirregular

inoutline.Thefine,highlydispersednuclearchromatinstainsalightreddish-purple,andoneortwopaleblueorcolorlesslargenucleoliarevisible.Thecytoplasmisusuallyagranularanddeeplytomoderatelybasophilic,withmarginal(peripheral)intensityacommoncharacteristic.(Smallrestinglymphocytesare6-8μmindiameter)41Smalllymphocytestransformedlymphocytes

(lymphoblasts,largecells)mitosismetaphase(Ag

ormitogen)stimulation①untransformedlymphocyte,small②transitionalcell③typicallymphoblast①③②untransformedlymphocyteLymphoblast,(transformedlymphocyte)核仁圖1狗外周血中的淋巴母細(xì)胞

顯微鏡下觀察典型淋巴母細(xì)胞，不要求計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。（四）結(jié)核病相關(guān)的免疫試驗(yàn)

(免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)在疾病診斷中的應(yīng)用舉例)

1.肺結(jié)核診斷需要做哪些檢查：（1）結(jié)核菌檢查：痰中找到結(jié)核菌是確診肺結(jié)核的主要依據(jù)。鏡檢（抗酸染色，熒光染色）；培養(yǎng)法（傳統(tǒng)或Bactec法等）；PCR法查痰；其他（ELISA）

（2）影像學(xué)檢查：胸部X線檢查不但可早期發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核，而且可對(duì)病灶作出判斷，對(duì)決定治療方案很有幫助。胸部CT檢查對(duì)于發(fā)現(xiàn)微小或隱蔽性病變，了解病變范圍及組成，對(duì)于診斷是有幫助的。

（3）結(jié)核菌素（簡(jiǎn)稱結(jié)素）試驗(yàn)：

IV型超敏反應(yīng)；陽性表明機(jī)體受到（或曾經(jīng)）結(jié)核菌感染或接種過卡介苗，也表示機(jī)體對(duì)結(jié)核菌有一定免疫力

（4）其他檢查：血沉，CRP(免疫比濁法)等，在評(píng)價(jià)肺結(jié)核病情活動(dòng)性有一定的價(jià)值。

2.肺結(jié)核檢查中免疫相關(guān)實(shí)驗(yàn)：（1）結(jié)核菌檢查：熒光染色鏡檢找結(jié)核菌；

（2）結(jié)核菌素（簡(jiǎn)稱結(jié)素）試驗(yàn)用于診斷結(jié)核菌感染的皮膚試驗(yàn)。為IV型超敏反應(yīng)，遲發(fā)型超敏反應(yīng)：

原理：抗原(結(jié)核菌或卡介苗)進(jìn)入機(jī)體使機(jī)體的免疫T淋巴細(xì)胞致敏，并大量分化增殖。當(dāng)已致敏的機(jī)體再次遭受到抗原入侵時(shí)，致敏淋巴細(xì)胞就會(huì)與之結(jié)合，引起變態(tài)反應(yīng)性炎癥。表現(xiàn)在結(jié)核菌素注射部位形成硬結(jié)甚至發(fā)生水泡、壞死。陽性表明機(jī)體受到或曾經(jīng)受到結(jié)核菌感染或接種過卡介苗；陰性可能免疫力低下或卡介苗接種失敗或未感染過結(jié)核菌，也可能技術(shù)原因而呈現(xiàn)假陰性；陰性大多可除外結(jié)核感染。

結(jié)核菌素（結(jié)素）試驗(yàn)類型OT試驗(yàn)：前臂皮內(nèi)注射OT，5IU。舊結(jié)素（oldtuberculin，OT）是從生長過結(jié)核菌的液體培養(yǎng)基中提煉出來的結(jié)核菌代謝產(chǎn)物，主要含有結(jié)核蛋白。注射后分別于24、48、72小時(shí)觀察反應(yīng)一次（以72小時(shí)的結(jié)果為準(zhǔn)）。局部硬結(jié)小于5mm為陰性，5－9mm為弱陽性，10－19mm為陽性反應(yīng)，20mm以上或局部發(fā)生水泡與壞死者為強(qiáng)陽性反應(yīng)。PPD試驗(yàn)：前臂皮內(nèi)注射PPD，5IU。結(jié)素的純蛋白衍化物（purifiedproteinderivative，PPD）為純結(jié)素，不產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。硬結(jié)平均直徑≥5mm為陽性反應(yīng)。陽性的意義：陽性表示曾感染結(jié)核