PAGEPAGE57第三章電泳技術(shù)實驗一核酸(DNA或RNA)的瓊脂糖凝膠電泳一、原理和用途DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖—磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如pUCl9質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA，簡稱CCCDNA)，開環(huán)質(zhì)粒DNA(opencircularDNA，簡稱OCDNA)，線狀質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2條鏈發(fā)生斷裂(1inearDNA，簡稱LDNA)。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)?！狣NA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳是DNA不同長度片段分開常用的方法，根據(jù)DNA的長度不同，常用的瓊脂糖凝膠濃度也不同（見表3－1）表3－1瓊脂糖凝膠濃度與可分離的DNA長度片段范圍瓊脂糖凝膠濃度(%)片段可分區(qū)域(kb)0.35～600.61～100.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～32.00.1～2二、實驗材料分離純化的核酸(DNA或RNA)。三、溶液與緩沖液10×TBE緩沖液900mmol/LTris900mmol/L硼酸100mmol/LEDTApH調(diào)至8.0高壓滅菌用時可稀釋為0.5×或1×TBE緩沖液用。10mg/mL溴化乙啶染色液溴酚藍(lán)電泳加樣緩沖液0.25％溴酚藍(lán)0.25％二甲苯青FF40％（W/V）蔗糖水溶液4.λ-DNAMarker/HindIII(片段：23.1，9.36，6.56，4.35，2.32，2.03，0.56，0.13kb)四、儀器設(shè)備及耗材電泳儀，電泳槽，凝膠板槽，膠梳子，微波爐，電子天平，旋渦振蕩器，小型高速離心機(jī)，凝膠成像儀或紫外透射議，高壓滅菌鍋，離心管架，吸頭盒，2μL、10μL、100μL移液器，10μ、200μL吸頭，1.5mL離心管，膠帶紙等。五、實驗方法將凝膠槽擦洗干凈，用膠帶紙將兩端封住，插上梳子。0.8g瓊脂糖懸浮在100mL1×TBE緩沖液中，微波爐中2～4min溶解。當(dāng)溶液溫度降至60℃時，加入溴化乙啶溶液，至終濃度為0.5μg/mL，混勻。立即將瓊脂糖溶液倒入膠槽。注意：不要出現(xiàn)氣泡！等凝膠完全冷卻凝固（即約30～45min）后，拔掉梳子，去掉兩端膠帶紙，將凝膠移置到電泳槽中。給電泳槽中加入0.5×或1×TBE緩沖液至高出膠面2～5mm.給每個樣品加入5μL的溴酚藍(lán)溶液，混勻。DNAMarker：18μLTE緩沖液，5μL溴酚藍(lán)溶液，2μL0.5μg/μLλ-DNAMarker/HindIII,混勻。將樣品和λ-DNAMarker/HindIII，分別加到凝膠的樣品孔中，一般DNAMarker加在兩邊。72V電泳約2～5h或36V電泳2～10h。在紫外透射儀上觀察，如果電泳很好，可照相，作進(jìn)一步分析，或者作Southern印跡等。注意：溴化乙啶是一個很強(qiáng)的誘變劑并有中度毒性。使用含有該染料的溶液時，要帶上手套，其用后的溶液和凝膠要統(tǒng)一收集處理。六、作業(yè)與思考題DNA的分子大小與遷移速率的關(guān)系如何？瓊脂糖凝膠濃度對DNA電泳有何影響？不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠電泳時的速率相同嗎？實驗二核酸聚丙烯酰胺凝膠電泳一、原理和用途丙烯酰胺是一單體結(jié)構(gòu)，由過硫酸胺提供并被TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙二胺）所穩(wěn)定的自由基可以引發(fā)一個鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使丙烯酰胺單體聚合成長鏈。同時雙功能基團(tuán)N,N′－亞甲基雙丙烯酰胺參與聚合反應(yīng)，使得鏈與鏈之間交聯(lián)成凝膠。聚丙烯酰胺凝膠與瓊脂糖凝膠相比，其制備和操作相對困難，需要在垂直電泳槽中進(jìn)行；但聚丙烯酰胺凝膠在分離小片段DNA分子時效果很好，其分辨率極高，相差1bp的DNA片段都能分開，而且在一個標(biāo)準(zhǔn)點樣孔中可以容納相對大量的DNA。常用的聚丙烯酰胺凝膠有兩種：非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性聚丙烯酰胺凝膠，前者用于分離和純化雙鏈DNA片段，后者用于分離和純化單鏈DNA片段。本實驗僅僅介紹非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。該方法已廣泛用于動、植物微衛(wèi)星DNA（shorttandemrepeat，STR）的檢測，以利于遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀基因定位、標(biāo)記輔助選擇、親子鑒定及生物多樣性研究等。二、實驗材料分離純化的核酸(DNA或RNA)。三、溶液與緩沖液10×TBE緩沖液30%丙烯酰胺凝膠溶液29g丙烯酰胺+N,N′－亞甲基雙丙烯酰胺1g加水至100mL，37℃溶解，置于棕色瓶中4℃保存。溴酚藍(lán)電泳加樣緩沖液。10%過硫酸胺（APS）。TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙二胺）。DNAMarker。銀染溶液的組成：（1）固定液：10%乙醇。（2）氧化液：1%硝酸。（3）染色液：0.1%AgNO3（4）顯色液：2%NaCO3。無水碳酸鈉6g，硫代硫酸鈉0.3mg，溶于300mL純水中，用時加入37%甲醛0.4mL。（5）終止液：4%醋酸四、儀器設(shè)備及耗材電泳儀，垂直電泳槽，脫色搖床，膠梳子，微波爐，電子天平，凝膠成像儀，離心管架，吸頭盒，10L微量注射器，2L、10L、100L移液器，10L、200L吸頭，1.5mL離心管，膠帶紙等。五、實驗方法1．聚丙烯酰胺凝膠的制備、點樣與電泳電泳裝置的準(zhǔn)備：將聚丙烯酰胺垂直電泳槽中的凝膠玻璃板充分洗凈，涼干后小心裝入膠框，再裝在垂直電泳槽中，將螺絲擰緊，然后用1%瓊脂糖凝膠封住膠框的下邊以防漏膠。聚丙烯酰胺凝膠的制作：（8%PAGE）30%丙烯酰胺9.5mL（避光4℃保存）5×TBE6mL加水至30mL10%APS210LTEMED18L合計30mL注意：根據(jù)垂直電泳槽的大小確定聚丙烯酰胺凝膠的體積。灌膠、點樣：將膠混勻后快速倒入玻璃板夾層中，插入梳子，待膠凝固后（1h以上），拔掉梳子，用水沖洗加樣孔，然后用移液器或吸水紙吸取水分（目的是防止電泳后帶不整齊），再點樣，并加DNAMarker。電泳：向膠槽中倒入電泳緩沖液（0.5×TBE），200V～300V電泳至溴酚藍(lán)電泳加樣緩沖液適當(dāng)位置時（電泳3h左右），停止電泳?；厥沾怪彪娪静壑械碾娪揪彌_液，卸下玻璃板，將其置于染色缸內(nèi)，用薄鋼勺或刀片小心地將上面的玻璃板從一角撬起，將上面的玻璃板平穩(wěn)的拿開。有時候凝膠仍附著在下面的玻璃板上，可連同玻璃板進(jìn)行染色，很快凝膠即從玻璃板上脫落。2．聚丙烯酰胺凝膠中DNA的染色常用的染色方法兩種，一種為溴化乙錠染色法，另一種為硝酸銀溶液染色法本實驗介紹常規(guī)的硝酸銀溶液染色法。將染缸中的凝膠，先用蒸餾水沖洗一遍。固定：加入10%乙醇固定10min，棄去固定液。氧化：加入1%硝酸，3min，棄去氧化液。用水漂洗2次，每次10s。染色：加入0.1%AgNO3，放在脫色搖床上15～30min后，將硝酸銀倒掉，用水沖洗15s。顯色：用2%NaCO3顯色，待條帶清晰后將溶液倒掉，然后加入4%的乙酸溶液停止顯色?；厥找宜崛芤捍笥?。膠浸泡水中至照相。四、作業(yè)與思考題為什么在核酸聚丙烯酰胺凝膠電泳時要用垂直電泳槽？實驗三蛋白質(zhì)電泳一、原理和用途將蛋白質(zhì)在含陰離子去污劑SDS和還原劑的溶液中，使其解離成單個多肽鏈，變性的多肽鏈與SDS結(jié)合，成為帶負(fù)電荷的分子，多肽鏈結(jié)合SDS的量與其分子量成正比，而與其序列無關(guān)。在電場中，帶負(fù)電荷的SDS-多肽結(jié)合物通過聚丙烯酰胺凝膠向正極移動，其遷移的速度與多肽鏈的分子量成反比，據(jù)此將分子量不同的多肽鏈分開，通過與已知分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)同時電泳，便可估計出樣品蛋白的分子量，但不能代表糖基化蛋白質(zhì)的實際分子量。聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS）是蛋白多肽鏈分析的最常用方法之一，可用于復(fù)雜蛋白質(zhì)的分離和多肽鏈的分子量測定，也是Western雜交（Westernblotting）等試驗的必需步驟。影響凝膠分離結(jié)果的因素很多。其中，膠的質(zhì)量是關(guān)鍵之一，上樣量太大常常導(dǎo)致電泳條帶重疊不清，電壓太高往往導(dǎo)致條帶扭曲不整，邊緣孔的條帶一般呈傾斜狀，由所謂的邊緣效應(yīng)（side-effect）引起。電壓過高可使電泳液溫度升高，引起玻璃板與固定部件膨脹不均，進(jìn)而導(dǎo)致玻璃板的斷裂損壞。此玻璃板非一般玻璃能取代，實驗操作時應(yīng)格外小心。值得注意的是，本實驗所用試劑多數(shù)具有強(qiáng)烈毒性，特別是未聚合狀態(tài)的丙烯酰胺具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性，實驗操作時必須采取戴手套等防護(hù)措施，最好在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。如分析樣品需進(jìn)行放射性標(biāo)記，應(yīng)嚴(yán)格按照放射性同位素操作規(guī)范進(jìn)行。二、實驗材料待測蛋白質(zhì)樣品。三、溶液與緩沖液1．制膠母液30%丙烯酰胺混合液1.5mol/LTris，pH8.810%SDS10%過硫酸銨TEMED2．蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)3．50%異丙醇4．2×蛋白加樣緩沖液5．5×電泳貯存液6．考馬氏亮藍(lán)染色液7．脫色液四、儀器設(shè)備及耗材垂直電泳槽（含制膠玻璃板及梳子），電泳儀，電爐或水浴箱，螺口指形管，微量加樣器，彎頭滴管等。五、實驗方法據(jù)儀器說明書準(zhǔn)備和組裝玻璃板，用少量去離子水檢查組裝好的玻璃板可是否滲漏。根據(jù)玻璃板大小確定分離膠的用量(見表3－4)，向燒杯中依次加入表中所列溶液，混合后立即用帶針頭的注射器將混合液傾注于玻璃板的夾層中。為防止出現(xiàn)氣泡，應(yīng)將玻璃板保持一定的角度，讓液體自然流入。分離膠高度以梳齒下1cm為度，頂部加以少量0.1%SDS或50%異丙醇，以防止水分蒸發(fā)。將灌制好的凝膠垂直放置，室溫下聚合。表3－4不同濃度和體積分離膠配方（HarlowandLane,1988）膠濃度母液不同體積分離膠的用量（mL）5101520253040506%H2O30%丙烯酰胺1.5mol/LTris（pH8.8）10%SDS10%過硫酸銨TEMED2.61.013.0.050.050.0045.32.02.50.10.10.0087.93.03.80.150.150.01210.64.05.00.20.20.01613.25.06.30.250.250.0215.96.07.50.30.30.02421.28.010.00.40.40.03226.510.012.50.50.50.048%H2O30%丙烯酰胺1.5mol/LTris（pH8.8）10%SDS10%過硫酸銨TEMED2.31.31.30.050.050.0034.62.72.50.10.10.0066.94.03.80.150.150.0099.35.35.00.20.20.01211.56.76.30.250.250.01513.98.07.50.30.30.01818.510.710.00.40.40.02423.213.312.50.50.50.0310%H2O30%丙烯酰胺1.5mol/LTris（pH8.8）10%SDS10%過硫酸銨TEMED1.91.71.30.050.050.0024.03.32.50.10.10.0045.95.03.80.150.150.0067.96.75.00.20.20.0089.98.36.30.250.250.0111.910.07.50.30.30.01215.913.310.00.40.4001619.816.712.50.50.50.0212%H2O30%丙烯酰胺1.5mol/LTris（pH8.8）10%SDS10%過硫酸銨TEMED1.62.01.30.050.050.0023.34.02.50.10.10.0044.96.03.80.150.150.0066.68.05.00.20.20.0088.210.06.30.250.250.019.912.07.50.30.30.01213.216.010.00.40.40.01616.520.012.50.50.50.0215%H2O30%丙烯酰胺1.5mol/LTris（pH8.8）10%SDS10%過硫酸銨TEMED1.12.51.30.050.050.0022.35.02.50.10.10.0043.47.53.80.150.150.0064.610.05.00.20.20.0085.712.56.30.250.250.016.915.07.50.30.30.0129.220.010.00.40.40.01611.525.012.50.50.50.02表3－5層積膠的配方(HarlowandLane,1988)溶液不同體積層積膠所需的量（mL）123456810H2O30%丙烯酰胺混合液1.0mol/LTris（pH6.8）10%SDS10%過硫酸銨TEMED0.680.170.130.010.010.0011.40.330.250.020.020.0022.10.50.380.030.030.0032.70.670.50.040.040.0043.40.830.630.050.050.0054.11.00.750.060.060.0065.51.31.00.080.080.0086.81.71.250.10.10.0130min后，輕輕地將鋪蓋在分離膠頂部的液體倒出，并用去離子水洗滌2~3次，以去除未聚合的凝膠，然后用吸水紙吸干殘留液體。按表3－5配制層積膠，灌膠（方法同分離膠）后將梳子輕輕地插入層積膠中（注意梳齒周圍不應(yīng)有氣泡，必要時補(bǔ)加適量層積膠，以防梳齒間出現(xiàn)空隙），并在室溫下聚合。在上述聚合過程中，即開始準(zhǔn)備電泳樣