完善.格式.編輯 專(zhuān)業(yè)專(zhuān)業(yè).資料.整理抗性淀粉及總淀粉測(cè)定方法承受Megazyme抗性淀粉試劑盒法，測(cè)定方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)〔下附〕法32-40〕抗性淀粉的測(cè)定方法：樣品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶〔AMG〕37℃振蕩水浴孵育16小時(shí)，在這期間，通過(guò)兩種酶的聯(lián)合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育完畢后，參加等體積的乙醇或工業(yè)甲基化酒精〔IMS,變性乙醇〕終止反響。離心上述溶液，收集上清勿棄，底部殘留絮狀團(tuán)即為樣品中的RS，用含水的IMS或乙醇〔50%v/v〕洗滌絮狀團(tuán)，洗滌后離心，再重復(fù)一次洗滌離心，收集離心后獲得的上清，與之前收集的上清混合。留神倒出試管殘留的液體，將絮狀團(tuán)置于冰水浴中，參加2MKOH溶解，溶解的同時(shí)用磁力攪拌機(jī)猛烈攪拌。用醋酸鹽緩沖液將這個(gè)溶液調(diào)至中性，用AMG將淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/過(guò)氧化物酶試劑〔GOPOD〕測(cè)定，這也是對(duì)樣品中RS含量的測(cè)定。非抗性淀粉〔可溶性淀粉〕的測(cè)定可通過(guò)集中的上清液并定容至100mL，再用GOPODD-葡萄糖完成?？偟矸蹨y(cè)定方法：即抗性淀粉與非抗性淀粉總和。抗性淀粉檢測(cè)試劑盒K-RSTAR〔100次分析〕應(yīng)用性和準(zhǔn)確性RS2%w/wRS2%w/w，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)誤差為±5%2%w/wRS的誤差更高。試劑盒1AMG，12mL，3300U/mLpH4.5，40℃下，底物為可溶性淀粉，[200U/mLpH4.5，40℃下，底物為對(duì)硝基苯基β-麥芽糖苷]。AMG溶液應(yīng)完全沒(méi)有可檢測(cè)到的游離D-葡萄糖。4℃下穩(wěn)定性>3年。2：α-胰淀粉酶(胰酶，10g，3CeralphaU/mg)。4℃下穩(wěn)定性>3年。瓶子D試劑緩沖液。磷酸鉀緩沖液，對(duì)羥基苯甲酸〕和疊氮化鈉>3年。瓶子4：GOPOD試劑酶。葡糖氧化酶〔>12,000U〕加上過(guò)氧化物酶〔>650U〕和4-氨基安替比林5年。瓶子：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液5〕溶于苯甲酸〔。室溫下穩(wěn)定性>5年。6：抗性淀粉比照?？剐缘矸酆咳绫硭尽Ｊ覝叵路€(wěn)定性>5年。溶液/懸浮液的制備使用瓶子1中供給的的產(chǎn)品；溶液。這個(gè)溶液是有粘性的，因此應(yīng)使用正向移液器移取分裝。4℃下穩(wěn)定性>3年。AMG〔300U/mL2mL1AMG0.1M順丁烯二酸鈉緩沖液〔0.1M，pH6.01，非供給〕稀釋至22mL5mL為單位分裝后用聚丙烯管冷凍保存。反復(fù)凍融不會(huì)影響穩(wěn)定性，穩(wěn)定性-20℃>5年。用前制備100mL順丁烯二酸鈉緩沖液(100mM，pH6.01，非供給)1g2中α，攪拌5分鐘。參加L稀釋的〔0/10分鐘，漸漸倒出上清液，這就是制備的溶液22制備后應(yīng)當(dāng)天使用。3中的產(chǎn)品〔GOPOD試劑緩沖液〕稀釋至1L，這就是制備的溶液3。制備后馬上使用。備注：假設(shè)濃縮緩沖液在-20蒸餾水稀釋。這個(gè)緩沖液包含0.4%〔w/v〕的疊氮化鈉。因此這是個(gè)有毒化學(xué)物，應(yīng)進(jìn)展相應(yīng)的處理。3320mL4里全部的產(chǎn)品，定量轉(zhuǎn)移這個(gè)溶液至裝有剩余溶液3的瓶子中。用鋁箔封蓋瓶子以遮光。這就是葡萄糖測(cè)定試劑D試劑，2-53個(gè)月或者-20℃下保存一年。假設(shè)試劑要以冷凍態(tài)儲(chǔ)存，應(yīng)分裝后再凍存。4℃儲(chǔ)存2-3個(gè)月時(shí)會(huì)演化成深粉色。當(dāng)以蒸餾水為比照時(shí)，這個(gè)溶液的吸光度應(yīng)小于0.05。5&6.56供給的產(chǎn)品。室溫下穩(wěn)定性>5年。沒(méi)有供給的試劑〔應(yīng)購(gòu)置分析純級(jí)〕順丁烯二酸鈉〔馬來(lái)酸鈉〕緩沖液(100mM，pH6.0)5mM二水氯化鈣和疊氮化鈉〔0.02%w/v〕.1600mL23.2g4M〔160g/L〕pH6.0，0.74g0.4g2L。4℃下可保存一年。醋酸鈉緩沖液〔1.2M，PH3.8〕69.6mL的冰醋酸〔1.05g/mL〕800mL4MpHpH3.81L，室溫下可保存一年。3.醋酸鈉緩沖液〔100mM，PH4.5〕5.8mL900mL4MpH4.5。用蒸餾1L，42個(gè)月。氫氧化鉀溶液〔2M〕112.2gKOH900mL的去離子水中，攪拌溶解。定容至1L，密封保存。室溫下2年。含水乙醇〔或者〔大約〕500mL乙醇〔95%v/v99%v/v〕或者工業(yè)甲基化酒精〔IMS；變性乙醇；95%v/v5%甲醇〕500mL的水中。密封保存，室溫下穩(wěn)定保存>2年。備注：RS0.6%-78%w/wMegazyme公司購(gòu)置。設(shè)備〔推舉〕1.0mm磨碎機(jī)替代。絞肉機(jī)-4.5mm篩。臺(tái)式離心機(jī)-16×120mm1500g(3000rpm)振蕩水浴器，可設(shè)定為每分鐘0次直線運(yùn)動(dòng)〔振蕩速度為每分鐘0里程35mm,37℃。水浴鍋-50+0.1℃。渦旋混勻器。磁力攪拌器。磁力攪拌棒-5×15mm。pH計(jì)計(jì)時(shí)器分析天平〔0.1毫克〕分光光度計(jì)-510nm〔10mm路徑長(zhǎng)度〕13.100μL移液器及一次性槍頭連續(xù)安排器-50mL2.0mL，3.0mL4.0mL。培育管-螺旋帽，16×125mm玻璃試管-16×100mm，14mL容量塑料盒，可放置試管架，也可作為冰盒使用。18.溫度計(jì)-37+0.150+0.1℃。19.容量瓶-100mL，200mL，500mL，1L，2L樣品制備用磨碎機(jī)研磨大約50g1.0mm篩。轉(zhuǎn)移全部的材料至廣口瓶，顛倒振蕩混勻。工業(yè)淀粉一般不用研磨。用絞肉機(jī)粉碎鮮〔如罐裝的豆子，香蕉，土豆，過(guò)m篩。用C法〔，測(cè)定干樣中的含水量，依據(jù)AOAC925.10，凍干后烘爐枯燥測(cè)定鮮樣中的含水量。分析方法水解和溶液化非抗性淀粉準(zhǔn)確稱(chēng)取100mg〔±5mg〕樣品后直接倒入有螺旋帽的試管里，輕柔的拍打試管以保證樣品集中在底部。留意：對(duì)于濕樣，樣品或許為0.5g(準(zhǔn)確稱(chēng)重)，這些材料的含水量通常為60-80%。每個(gè)試管中參加0〔0其中含有3〔溶液〕蓋緊試管蓋子，用渦旋振蕩器混勻，臥式放入振蕩水浴器，與運(yùn)動(dòng)方向平行。如以下圖所示：連續(xù)振蕩，3716〔備注：200里程/min〕4.0mL〔99%v/v〕或者〔%，用渦旋器渦旋。6.1500g離心，10分鐘〔不加蓋〕2mL50%50%IMS6mL50%IMS，混合，1500g離心，10分鐘留神倒出上清，重復(fù)上述重懸浮和離心步驟。留神倒出上清，翻轉(zhuǎn)試管，用紙巾吸除多余的液體。測(cè)定抗性淀粉含量2mL2MKOH，用磁力攪拌機(jī)在冰浴/20minRS。如以下圖所示：備注：不要使用渦旋器混勻，那將會(huì)導(dǎo)致淀粉乳化。KOH溶液邊猛烈攪拌試管里的樣品。這將會(huì)避開(kāi)形成難溶的淀粉塊。向每個(gè)試管中參加8M的醋酸鈉緩沖液，并用磁力攪拌機(jī)攪拌。馬上0.1mLAMG〔1；3300U/mL〕,50℃水浴。3.30min,期間用渦旋器間歇混勻。RS含量>10%100mL當(dāng)用洗瓶洗滌試管中的溶液時(shí)用外磁鐵保持試管中的磁力棒。用蒸餾水定容至100mL，并混勻。以單位體積離心溶液，1500g，10min。對(duì)于RS含量<10%的樣品，直接離心1500g,10min〔非稀釋。對(duì)于這些的樣品，試管里的最終體積大約為10.3mL〔體積可能會(huì)變化，假設(shè)分析的是濕樣，在計(jì)算數(shù)值時(shí)應(yīng)留意折扣〕〔上清液以L為單位轉(zhuǎn)移至玻璃試，一式兩份，參加D試劑〔溶液，℃孵育0分鐘。7.510nm下相對(duì)于空白試劑的吸光度值。制備空白試劑L的M〔和L的試劑制備D-葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)品〔一式四份〕0.1mLD-葡萄糖〔1mg/mL〕和3.0mL的GOPODD-葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)品。計(jì)算非抗性〔可溶性的〕淀粉收集起始孵育[(a)7.]過(guò)程中離心獲得上清液和兩次50%乙醇洗滌[(a)8.和9.]獲得的上100mM的醋酸鈉緩沖液〔pH4.5〕100mL。混勻。0.1mL為單位孵育溶液〔一式兩份〕10μLAMG溶液(300U/mL),℃孵育0分鐘參加0LD試劑〔溶液，℃孵育0分鐘。510nm下相對(duì)于空白試劑的吸光度值。計(jì)算非抗性淀粉的含量。計(jì)算計(jì)算樣品中抗性淀粉含量，非抗性淀粉含量和總淀粉含量〔%，在干重的根底上算模板如下：抗性淀粉g樣品〔〕=⊿E×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180=⊿E×F/W×90抗性淀粉g樣品〔〕=⊿E×F×10.3/0.1×1/1000×100/W×162/180=⊿E×F/W×9.27非抗性淀粉含量〔g/100g樣品〕=⊿E×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180=⊿E×F/W×90總淀粉含量=抗性淀粉含量+非抗性淀粉含量⊿E=相對(duì)于空白試劑的吸光度值F=從吸光度值到微克的轉(zhuǎn)換〔GOPOD反響中100μgD-葡萄糖的吸光度值是確定的，F(xiàn)=100〔D-葡萄糖的μg數(shù)〕100μgD-GOPOD吸光度值〕100/0.1=體積校正〔100mL0.1mL〕1/1000=從微克到毫克W=分析樣本的干重=重量×〔100-含水量〕/100100/W=RS在樣品重量中百分比因子162/180=D-葡萄糖轉(zhuǎn)換到淀粉中存在的脫水-D-葡萄糖的因子體積校正〔從3L取，對(duì)于含有，當(dāng)孵育溶液時(shí)沒(méi)有被稀釋?zhuān)罱K體積為-10.3mL。當(dāng)分析濕樣時(shí)，體積會(huì)增大，在計(jì)算時(shí)應(yīng)計(jì)算折扣。淀粉來(lái)源RS(試管內(nèi)分析方法/結(jié)果)a淀粉來(lái)源RS(試管內(nèi)分析方法/結(jié)果)aRS(活體)EnglystFaisantC