農(nóng)學(xué)糧油檢驗維生素第1頁/共35頁2023/3/72第七節(jié)食品中維生素的測定

1.維生素分類維生素按溶解特性劃分，可分為水溶性維生素和脂溶性維生素兩大類。水溶性維生素有：硫胺素、核黃素、泛酸、維生素B6、葉酸、生物素、抗壞血酸、煙酸。脂溶性維生素有：視黃醇、鈣化醇、生育酚、抗出血維生素。除維生素外，還有一些維生素的前體物，如胡蘿卜素，即為維A原，在生物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變成維生素?，F(xiàn)在工業(yè)化生產(chǎn)中，還有作為添加劑使用的維生素衍生物。第2頁/共35頁2023/3/73第七節(jié)食品中維生素的測定2.維生素類添加劑在食品和飼料中，除天然維生素以外，為了強化營養(yǎng)、增加抗氧化能力，常常還要添加一些維生素的衍生物。①維生素A醋酸酯、維生素A琥珀酸酯②硫胺素十六烷基硫酸鹽、硫胺素-1，5-二磺酸鹽、月桂基硫酸鹽二苯硫胺素③核黃素磷酸酯鈉、核黃素酪酸酯④抗壞血酸硬脂酸鈉第3頁/共35頁2023/3/74第七節(jié)食品中維生素的測定3.維生素的特性一般來講，維生素對外界因素的影響非常敏感，在提取、測定及樣品保存過程中要特別注意。酸堿氧光熱維生素A※※維生素D※※※維生素E※※維生素K※※維生素B1※※※維生素B2※※※維生素B6※※泛酸※※※葉酸※※維生素B12※※維生素C※※※※維生素PP生物素第4頁/共35頁2023/3/75第七節(jié)食品中維生素的測定4.維生素的測定方法糧食、食品和飼料中的維生素的主要有：高壓液相色譜法、熒光分光光度法和比色法，微生物法已逐步被淘汰。其中，高壓液相色譜法以其高分離能力、高靈敏度的檢測，被廣泛地應(yīng)用。第5頁/共35頁2023/3/76第七節(jié)食品中維生素的測定二、維生素A和維生素E的測定維生素A、維生素E都是脂溶性維生素，它們對光、氧很敏感，在提取和測定過程中，要避光、隔氧進(jìn)行，否則，它們迅速被氧化分解，使測定結(jié)果偏低，甚至測不到。維生素A只有動物性食品中含有，維生素E在動物性、植物性食品中都含有。第6頁/共35頁2023/3/77二、維生素A和E的測定(一)高壓液相色譜法1.原理將樣品中油脂皂化，用脂溶性溶劑提取維生素A和維生素E，采用高壓液相色譜儀分離分析。色譜條件為C18柱，紫外檢測器，反相色譜法進(jìn)行分離，以苯并芘為內(nèi)標(biāo)物，內(nèi)標(biāo)法定量。高壓液相色譜法分析維生素A時，采用正相色譜法和反相色譜法都可以進(jìn)行。第7頁/共35頁2023/3/78二、維生素A和E的測定2.色譜分離系統(tǒng)選擇如果采用正相色譜法，色譜柱主要是硅膠柱，而流動相是以正己烷為基本溶劑，加適量異丙醇、乙醚、正辛醇等試劑調(diào)節(jié)流動相極性。這樣的色譜條件要求樣品提取液應(yīng)不含水和堿性成分。如果采用反相色譜法，色譜柱主要是C18柱，而流動相是以甲醇、乙腈為主要溶劑，水為極性調(diào)節(jié)劑的溶劑系統(tǒng)。樣品提取液中的極性成分對反相色譜法的柱效影響不大，對于一些維生素含量高的樣品，可以直接用油樣或脂溶性溶劑的抽提物進(jìn)行分析。第8頁/共35頁2023/3/79二、維生素A和E的測定3.分析維生素A或維生素E的色譜條件1）用于分析維生素A的HPLC系統(tǒng)2）用于分析維生素E的HPLC系統(tǒng)第9頁/共35頁2023/3/710二、維生素A和E的測定4.分析步驟皂化→提取→洗滌→干燥→濃縮→定容→離心→色譜分析→結(jié)果計算第10頁/共35頁2023/3/711二、維生素A和E的測定5.測定過程中的必須注意：①樣品制備、前處理過程中要避光、加抗氧化劑VC操作，必要時用氮氣隔離氧。②在進(jìn)行色譜分析時，所用試劑純度要分析純以上，否則，可能帶來新的干擾。第11頁/共35頁2023/3/712二、維生素A和E的測定③試劑、樣品提取液必須用超濾膜進(jìn)行過濾，將固體、流動相不溶性的膠體過濾掉。④對于分離不太好的結(jié)果，要正確選擇色譜數(shù)據(jù)處理方法。⑤具有很強分離能力的色譜柱，可以將維生素A、維生素E的異構(gòu)體分離，這時應(yīng)對各異構(gòu)體分別定量。第12頁/共35頁2023/3/713二、維生素A和E的測定（二）比色測定法維生素A1.原理維生素A在三氯甲烷溶液中，與三氯化銻作用生成藍(lán)色物質(zhì)，用分光光度計，于620nm波長處測定吸光度值。使用該方法測定維生素A時，維生素A的各種異構(gòu)體、胡蘿卜素及類胡蘿卜素都可以與三氯化銻呈藍(lán)色反應(yīng)，這種藍(lán)色物質(zhì)在6秒鐘內(nèi)穩(wěn)定。第13頁/共35頁2023/3/714二、維生素A和E的測定

2.注意①由于顯色后不能有較長的穩(wěn)定時間，測定誤差很大，必須由操作熟練的人員測定。②三氯化銻遇水產(chǎn)生白色沉淀，測定用樣液必須徹底脫水。③這種方法所測的是維生素A及A原的總量。第14頁/共35頁2023/3/715第七節(jié)食品中維生素的測定三、胡蘿卜素的測定胡蘿卜素是維生素A原，胡蘿卜素有多種異構(gòu)體，其中，-胡蘿卜素的生理效價最高，其次是-體和隱黃素。-胡蘿卜素顯深桔紅色，它既可以作為營養(yǎng)強化劑，也可以作為食用色素。第15頁/共35頁2023/3/716三、胡蘿卜素的測定1.原理食品中胡蘿卜素以及其它色素用乙醚和丙酮提取，然后以石油醚為展開劑，進(jìn)行紙層析分離。胡蘿卜素分子極性最小，比移值最大，層析結(jié)束后，將胡蘿卜素譜帶剪下，用溶劑洗脫，再用分光光度計于450nm波長處測定吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。該方法的最小檢出量為0.11g。第16頁/共35頁2023/3/717三、胡蘿卜素的測定2.操作流程樣品處理→提取→洗滌→濃縮→干燥→紙層析→洗脫→測定→結(jié)果計算第17頁/共35頁2023/3/718三、胡蘿卜素的測定3.測定方法

1）樣品前處理（1）樣品需經(jīng)低溫干燥，以避免胡蘿卜素被氧化。（2）對于低脂肪的果蔬類樣品，可以直接丙酮-石油醚混合溶劑提??；植物油和高脂肪含量樣品，必需經(jīng)過皂化，去除脂類的干擾，然后用石油醚提取。（3）提取液還需要反復(fù)用硫酸鈉水溶液洗滌，直至下層水溶液清亮為止，提取液還必須用水洗至中性，用無水硫酸鈉干燥提取液（4）提取液減壓濃縮干，然后重新定容，備用。第18頁/共35頁2023/3/719三、胡蘿卜素的測定2）層析（1）吸取濃縮樣液，點樣。（2）以石油醚作為展開劑進(jìn)行層析。（3）層析分離后，剪下位于展開劑前沿的胡蘿卜素色帶，立即放入石油醚溶劑中洗脫。

3）測定選擇450nm的光為測定波長，以石油醚調(diào)節(jié)分光光度計的零點。測定標(biāo)準(zhǔn)系列，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定樣液的吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。第19頁/共35頁2023/3/720第七節(jié)食品中維生素的測定四、硫胺素的測定硫胺素屬于水溶性的維生素，在堿性條件下不穩(wěn)定。測定硫胺素時，可采用經(jīng)重氮化反應(yīng)后的比色法進(jìn)行，也可以采用在堿性條件下，用鐵氰化鉀氧化為硫色素，進(jìn)行熒光法或高壓液相色譜法分析。還有采用紫外分光光度計直接測定硫胺素或焦磷酸硫胺素。國標(biāo)GB/T14700--93規(guī)定了飼料原料、配合飼料、維生素預(yù)混料等樣品中維生素的測定方法。第20頁/共35頁2023/3/721四、硫胺素的測定1.原理樣品經(jīng)酸水解、酶水解處理，用稀酸提取，提取液經(jīng)人造浮石凈化處理后，在堿性溶液中，高鐵氰化鉀將硫胺素氧化，生成一種具有藍(lán)色熒光的硫色素。熒光法測定硫色素時，激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為435nm。第21頁/共35頁2023/3/722四、硫胺素的測定2.人造浮石的活化取一定量的人造浮石，以10倍其容積的3%熱乙酸洗滌兩次，再用5倍其容積的25%熱氯化鉀洗滌，再用3%熱乙酸洗滌，最后用蒸餾水洗至沒有氯離子，干燥后密閉保存?；罨玫母∈?，必須做回收實驗，回收率要在92%以上。如果活力不夠，要重新活化或增加25%氯化鉀溶液的處理次數(shù)。第22頁/共35頁2023/3/723四、硫胺素的測定3.操作流程水解、酶解樣品→酸提取→凈化→堿性氧化→熒光測定→結(jié)果計算

1）提取硫胺素將樣品粉碎加酸并打成勻漿，高壓鍋中高壓酸解，冷卻，加入糖化酶進(jìn)行酶解。水解液過濾備用。樣品進(jìn)行酸解和酶解的目的，是將結(jié)合的、被淀粉及蛋白質(zhì)吸附的硫胺素釋放。第23頁/共35頁2023/3/724四、硫胺素的測定2）硫胺素提純將濾液加到已裝好浮石的柱子中，用熱水淋洗兩次，將提取液中的雜質(zhì)洗脫。用一定量的熱25%酸性氯化鉀分次洗滌柱子，將被吸附的硫胺素洗脫，收集洗脫液，即為提純的硫胺素。硫胺素標(biāo)準(zhǔn)溶液必須過浮石柱子，以消除浮石柱子回收率低帶來的影響。第24頁/共35頁2023/3/725四、硫胺素的測定3）氧化硫胺素在樣液管中，加15%氫氧化鈉溶液，準(zhǔn)確加一定量的正丁醇，加堿性鐵氰化鉀溶液，劇烈振搖，待分層后，取正丁醇溶液脫水。在硫色素的生成過程中，①樣品中含有還原性雜質(zhì)時，鐵氰化鉀溶液的用量要適量增加。第25頁/共35頁2023/3/726四、硫胺素的測定

②硫胺素的氧化、萃取同步進(jìn)行，硫胺素被氧化后，生成憎水性的硫色素而進(jìn)入正丁醇中，同時避免了硫色素被鐵氰化鉀的氧化。③可以使用二氯化汞和溴化氰作為氧化劑，這兩種氧化劑的的氧化專一性比鐵氰化鉀高，如對N-甲基煙酰胺的氧化。第26頁/共35頁2023/3/727四、硫胺素的測定4）測定用硫酸奎寧溶液校正熒光分光光度計。選擇測定波長：激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長435nm，分別測定空白試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品液的熒光強度值。第27頁/共35頁2023/3/728四、硫胺素的測定4.在使用熒光法測定中，影響測定結(jié)果的因素有：①儀器的不穩(wěn)定，引起熒光讀數(shù)的波動。②純化硫色素時，浮石柱子的吸附活性不夠高。③氧化硫胺素時，過量的堿性鐵氰化鉀氧化硫色素。第28頁/共35頁2023/3/729四、硫胺素的測定

④在硫色素的正丁醇溶液中的熒光淬滅劑，引起的熒光淬滅。引起熒光淬滅的因素：

a.碘離子、溴離子、氰酸根離子是典型的熒光淬滅劑

b.熒光物質(zhì)濃度太大時，溶液中溶質(zhì)分子自撞。

C.正丁醇溶液的pH引起的熒光淬滅。第29頁/共35頁2023/3/730第七節(jié)食品中維生素的測定五、熒光法測定核黃素核黃素微溶于水，水溶液中呈黃綠色熒光，不溶于有機(jī)溶劑，在強酸中穩(wěn)定，堿性溶液中光照易分解。核黃素的測定方法主要有直接熒光法、光黃素?zé)晒夥ê透邏阂合嗌V法。第30頁/共35頁2023/3/731五、熒光法測定核黃素1.原理用酸水解樣品，使VB2游離進(jìn)入酸