基因組學文獻第1頁/共23頁CloningandidentificationoftwonovelNBCe1splicevariants

frommousereproductivetracttissues:Acomparativestudy

ofNCBTgenes小鼠生殖道組織中兩種新型NBCe1拼接變種的克隆和鑒定：NCBT基因的比較研究第2頁/共23頁

摘要SLC4家族NCBT在細胞pH調(diào)控以及HCO3-的跨上皮細胞轉(zhuǎn)運中具有重要作用。本實驗用小鼠的生殖道組織進行系統(tǒng)的研究，它有5種NCBTs以及五個NBCe1（SLC4A4）變種NBCe1-A到EmRNA的表達，其中NBCe1-D和NBCe1-E是新的。克隆的NBCe1-D和NBCe1-E，都缺乏一個27堿基的序列，即cassetteI，揭示了一種新的替代老鼠SLC4a4基因的拼接單元。Slc4a4的合成（轉(zhuǎn)錄）缺乏cassetteI,表示在不同的小鼠組織中，通過RT-PCR分析顯示在不同組織中的其他脊椎動物種所示爆炸對GenBank數(shù)據(jù)庫?；蚪M序列分析表明，cassetteISLC4a4保護所有NCBT基因的除了SLC4A5，因為slc4a5大概在它進化中丟失了cassetteI。我們現(xiàn)在的研究結(jié)果也表明我們正向未知的NBCe1分子生理學和未確定的其他NCBTs邁出的重要一步。第3頁/共23頁1、介紹調(diào)制生殖道組織細胞液的碳酸氫鹽濃度[HCO3-]及pH值是哺乳動物的繁殖整個過程的關(guān)鍵。由微注射研究，Levine和Marsh表明，細胞腔[HCO3-]從曲細精管20毫米大幅減少到附睪頭的2.7毫米，然后在尾附睪和輸精管的[27]逐漸上升到?6.7毫米。在細胞腔液中相對酸性pH值和低[HCO3-]是必不可少的渲染在附睪靜態(tài)精子。HCO3-是精子獲能的重要因素之一。在女性生殖道內(nèi)，HCO3-進入精子，激活精子可溶性苷酸環(huán)化酶，反過來又增加細胞內(nèi)cAMP[12]的水平。女性生殖道管腔液中的[HCO3-]可高于血漿中的2-4倍，說明子宮內(nèi)膜上皮細胞能執(zhí)行大量HCO3-分泌。第4頁/共23頁在哺乳動物生殖中pH和HCO3-的重要意義，極為重要的是要了解HCO3-分子機制在男性/女性生殖道上皮細胞的運輸。在生殖道參與HCO3-跨上皮細胞轉(zhuǎn)運的分子實體很大程度上仍不清楚。該五鈉耦合HCO3-的轉(zhuǎn)運（NCBTs）的溶質(zhì)載體4（SLC4）家族是一類主要的運營商為HCO3-運輸，并且在調(diào)節(jié)pH以及HCO3-的跨上皮細胞轉(zhuǎn)運中具有重要作用。NCBTs包括（a）兩個產(chǎn)電的成員NBCe1（SLC4A4）和NBCe2（SLC4A5），及（b）3個電中性的成員NBCn1（SLC4A7），NBCn2（SLC4A10，又名NCBE），及作為一個Na+驅(qū)動Cl-/HCO3-交換NDCBE（SLC4A8）。第5頁/共23頁由于選擇性剪接或使用不同啟動子進行轉(zhuǎn)錄，幾乎所有NCBT的基因都能夠產(chǎn)生多個變體。例如，SLC4A4基因（a）有兩個不同的啟動子，這允許該基因編碼兩種類型的氨基末端（Nt），和（b）一種已知的選擇性剪接單元，即外顯子24，其允許該基因編碼兩種類型的羧基末端（CT）。根據(jù)這兩個已知的變化，SLC4A4基因可以產(chǎn)生高達四個變種。迄今為止，三個NBCe1變種NBCe1-A，-B，-C，已經(jīng)從人類和嚙齒動物中發(fā)現(xiàn)。NBCe1-A具有獨特的短氨基末端，而NBCe1-B/C有很長的NT。由于存在的外顯子24的含有一個終止密碼子，NBCe1-A/B有一個短CT，而由于24號外顯子的缺失NBCe1-C有獨特的長CT。第6頁/共23頁在本研究中，我們利用反向轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）系統(tǒng)地研究小鼠生殖道組織中的五個NCBTs的表達。此外，我們審查了NBCe1變種組織在雌性和雄性小鼠中的表達和分布。我們確定了兩個新NBCe1變體，即NBCe1-D和NBCe1-E，這兩者缺乏9氨基酸卡帶，指定為cassetteI，在NTNBCe1。通過基因檢測基因組DNA分析來測試cassetteI在其他NCBT的演變。第7頁/共23頁2、方法2.1、組織采集和RNA分離收集老鼠生殖道組織，立即在液氮中冷凍，然后保存于-80°C，直到被用于RNA制備。按照制造商的說明制備總RNA的TRIzol試劑。從2-4只小鼠提取約100–200mg的組織，放入盛有2毫升TRIzol試劑的容器，然后立即搖勻。然后將勻漿物在12000×g下離心5分鐘，在4℃下該水相轉(zhuǎn)移到一個干凈的試管中，加入萃取氯仿中，然后離心12,000×g下15分鐘，在4℃下該得到的水溶液phasewas保存和mixedwith異丙醇沉淀RNA。將RNA通過離心收集在7500×克5分鐘，在4°C。將沉淀物洗滌一次用75％enthanol，風干，然后貯存于-80℃直至使用。兩微克的總RNA，用于合成使用莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉(zhuǎn)錄的cDNA。RT-PCR方法用于分析被選擇的基因的mRNA的表達。第8頁/共23頁2.2、RT-PCR和cDNA克隆2.2.1、利用RT-PCR分析NCBTs或Actb的mRNASLC4A4，Slc4a5，Slc4a8，Slc4a10的mRNA通過巢式RT-PCR方法進行分析，而SLC4A7和Actb的mRNA編碼測試beta肌動蛋白通過單輪RT-PCR進行分析。用于分析RT-PCR的引物總結(jié)在補充表1。PCR進行是要有TaqDNA聚合酶。除非另有規(guī)定，所有的循環(huán)參數(shù)PCR反應(yīng)在94℃下30秒，55℃下30s，在72℃下40s，NCBTs為30周期，Actb是24周期。所有的PCR產(chǎn)物都要進行DNA測序分析。第9頁/共23頁2.2.2、NBCe1變種Nt的RT-PCR分析要檢測NBCe1（SLC4A4）變種在老鼠生殖道組織中的表達，我們首先設(shè)計可以區(qū)分NTNBCe1-A和NBCe1-B，-C的引物進行RT-PCR（補充表2），。用TaqDNA聚合酶進行PCR反應(yīng)。所有PCR反應(yīng)的自行參數(shù)分別為：在94℃30秒，55℃30秒，在72℃40秒，共30個循環(huán)。對通過RT-PCR得到的DNA進行序列分析。第10頁/共23頁2.2.3、克隆NBCe1變種的全長cDNA

為了確定NBCe1變種組織在生殖道中的表達，我們利用表2中總結(jié)的引物和HSDNA聚合酶對全長cDNA進行了RT-PCR。所有PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)是在98℃下10秒，在60℃下5秒，在72℃下255s，進行30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物都被限制性分解，然后亞克隆到載體pGH19[44]進行克隆篩選和DNA測序。第11頁/共23頁2.2.4、缺失盒式ISLC4A4的轉(zhuǎn)錄表達的分析要檢查小鼠細胞組織中的表達是否SLC4A4缺失盒式I，我們進行了巢式RT-PCR引物（參考表3）的側(cè)翼盒一，進行PCR反應(yīng)循環(huán)使用TaqDNA聚合酶。參數(shù)：94℃30秒，55℃30秒，在72℃40秒，共30個循環(huán)。除特殊的，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行分析。第12頁/共23頁3.1.NBCTmRNA在小鼠生殖系統(tǒng)中的表達第13頁/共23頁3.2.NBCT變種在小鼠生殖系統(tǒng)中的表達第14頁/共23頁第15頁/共23頁五個NBCe1變種在指定的組織的集落頻率分布第16頁/共23頁3.3.在小鼠SLC4A4基因中的一種新型的

選擇性剪接盒的鑒定第17頁/共23頁3.4.在小鼠和其他脊椎動物物種

SLC4A4轉(zhuǎn)錄的組織分布第18頁/共23頁4.討論在本研究中，我們在小鼠生殖道組織中發(fā)現(xiàn)并鑒定了Slc4a4基因的一個新的選擇性剪切單元，并且首次在小鼠生殖道組織中發(fā)現(xiàn)了NBCe1的兩種新型剪切體：NBCe1-D和NBCe1-E；在小鼠腦組織中我們首次克隆了NBCn2的第四種新型剪切體：NBCn2-D。此外，我們還檢測到SLC4家族的五種碳酸氫根轉(zhuǎn)運體NCBTs——NBCe1、NBCe2、NBCn1、NDCBE和NBCn2在小鼠雌性生殖道組織卵巢O（Ovary）、子宮U（Uterus）、陰道V（Vagina）以及雄性生殖道組織睪丸T（Tesis）、附睪E（Epididymis）、輸精管VD（Vasdeferens）中均有表達。這些結(jié)果提示鈉離子偶聯(lián)碳酸氫根轉(zhuǎn)運體NCBTs在調(diào)控pH及HCO3–濃度方面可能起到非常重要的作用，從而在哺乳動物的生殖（尤其是精子獲能中）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起到不可忽視的重要生理學作用。第19頁/共23頁4.1NCBT在生殖系統(tǒng)中的作用

pH調(diào)控和HCO3–在哺乳動物生殖中起著非常重要的作用。電生理技術(shù)和pH測定的研究結(jié)果提示，在生殖道上皮細胞具有鈉離子依賴的碳酸氫根（NCBT）轉(zhuǎn)運活性。研究初步表明在雌性生殖相關(guān)的系統(tǒng)中存在鈉離子碳酸氫根共轉(zhuǎn)運（NBC）活性，從而可能對雌性生殖具有重要作用。在精子中，研究表明多種離子轉(zhuǎn)運體參與了精子細胞HCO3–的跨膜轉(zhuǎn)運過程，包括囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)到調(diào)節(jié)因子（CFTR）(18)、SLC4A2（AE2）(46)、部分SLC26家族蛋白如SLC26A3(18)以及NCBT(32)等。Demarco等(24)的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠精子中存在鈉離子依賴的HCO3–跨膜轉(zhuǎn)運活性，HCO3–的跨膜轉(zhuǎn)運影響精子胞內(nèi)的蛋白磷酸化活動第20頁/共23頁NBCe1是介導HCO3–跨膜運輸?shù)腘CBT家族的成員，它在細胞的pH調(diào)控、酸堿平衡以及HCO3–的跨膜轉(zhuǎn)運過程中起著非常重要作用。NCBTs剪切異構(gòu)體的多樣性有著重要的生理學作用，表現(xiàn)在兩個方面。NCBT的選擇性剪切影響碳酸氫跟跨膜轉(zhuǎn)運體的內(nèi)在功能活性，這是由于選擇性剪切區(qū)域往往是一些調(diào)控蛋白的結(jié)合位點，因此含有或缺失特定的選擇性剪切單元會影響離子跨膜轉(zhuǎn)運體的功能調(diào)控的方式。一些研究表明，H