熒光免疫層析技術(shù)原理與進展熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第1頁熒光免疫層析技術(shù)基本原理層析法(chromatography)原理是利用混合物中各組分物理性質(zhì)之差(如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等)而建立來一個分離技術(shù)。層析系統(tǒng)是由固定相(stationaryphase)和流動(MobilePhase)相組成。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第2頁固定相是固體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)上成份。流動相是能夠流動物質(zhì)，如水或各種溶劑。層析過程：當(dāng)待分離混合物隨流動相經(jīng)過固定相時，因為混合物各組分理化性質(zhì)差異，與固定相相互作用弱組分隨流動相移動時受到阻滯作用小，向前移速度快；與固定相相互作用強組分向前移動速度慢。從而實現(xiàn)混合物中各組分分離。

熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第3頁

免疫層析法免疫層析技術(shù)是建立在層析技術(shù)和抗原一抗體特異性免疫反應(yīng)基礎(chǔ)上一項新興免疫檢測技術(shù)。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第4頁免疫層析技術(shù)以固定有檢測線和控制線條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，經(jīng)過毛細作用使待測物在層析條上移動。待測物在T線處發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。游離物在C線處發(fā)生免疫反應(yīng)。待測物層析方向免疫反應(yīng)TC免疫層析技術(shù)基本原理示意圖熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第5頁熒光（fluorescence）

熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱為熒光。

發(fā)射光譜和激發(fā)光譜發(fā)射光譜是指固定激發(fā)波長，在不一樣波長下統(tǒng)計樣品發(fā)射熒光強度。激發(fā)光譜是指固定檢測發(fā)射波長，用不一樣波長激發(fā)光激發(fā)樣品統(tǒng)計對應(yīng)熒光發(fā)射強度。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第6頁熒光效率定義:熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光百分率計算公式:

熒光效率=

熒光壽命定義:熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生熒光衰減到一定程度時所用時間。各種熒光物質(zhì)熒光壽命不一樣。

熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第7頁熒光淬滅定義:熒光物質(zhì)在一些理化原因作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。引發(fā)熒光淬滅原因：有如紫外線照射、高溫、一些硝基化合物、重氮化合物等。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第8頁免疫層析技術(shù)以固定有檢測線和控制線條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，經(jīng)過毛細作用使待測物在層析條上移動。待測物在T線處發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。游離物在C線處發(fā)生免疫反應(yīng)。待測物層析方向免疫反應(yīng)TC免疫層析技術(shù)基本原理示意圖熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第9頁熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第10頁競爭法待測物中某種抗原與T（檢測線）線處同種抗原競爭性地與標識抗體相結(jié)合過程。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第11頁

競爭法含抗原AY1:A單抗與標識物偶聯(lián)體Y2：抗原AY3:羊抗鼠二抗結(jié)合墊免疫層析法檢測實物圖熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第12頁夾心法待測物中某種抗體（抗原）與T線處抗原A（抗原A）以及熒光標識抗原（抗體）特異性相結(jié)合過程，在T線處形成抗體A+抗原+抗體B形式夾心結(jié)構(gòu)。結(jié)合墊免疫層析法檢測實物圖熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第13頁雙抗體夾心法(k)Ab1-Ag-Ab2(k)Ab1(k)Ab1-AgAb2Ab3-(k)Ab1TC陽性結(jié)果T,C都有顏色待測液含抗原Ag待測液，不含抗原Ag(k)Ab1(k)Ab1(k)Ab1Ab2TCAb3-(k)Ab1陰性結(jié)果T無顏色，C有顏色雙抗體加心法檢測原理圖K代表某一標識物結(jié)合墊免疫層析法檢測實物圖熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第14頁雙抗原夾心法雙抗原夾心反應(yīng)模式陽性檢測（左）與陰性檢測（右）熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第15頁利用熒光免疫層析試紙條能夠?qū)崿F(xiàn)對待測物定性或者定量檢測.熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第16頁熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第17頁金顆粒之間存在靜電斥力使其在水中保持相對穩(wěn)定狀態(tài)，形成穩(wěn)定水溶性膠體，即稱為膠體金膠體金熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第18頁膠體金現(xiàn)有明亮色彩，又有高電子密度，能夠吸附生物大分子，且不影響生物分子活性，故可作為生物分子標志物，用于免疫反應(yīng)中抗原或抗體標識定位，定性甚至定量研究。層析試紙標識用金顆粒直徑大多在20～40nm，呈深紅色。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第19頁膠體金標識蛋白質(zhì)過程是蛋白被動吸附到金顆粒表面過程。因為蛋白分子牢靠地結(jié)合在金顆粒表面，形成一個蛋白層，阻止了膠體金顆粒相互接觸，而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài)。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第20頁膠體金作為標志物有以下優(yōu)勢:①幾乎可標識全部蛋白分子，過程簡單，效率高，用量少，廉價，基本不改變被標識蛋白活性。且穩(wěn)定，無毒，使用方便，保質(zhì)期長。②不一樣直徑納米金能夠用于多重標識。③結(jié)果判斷只需普通光學(xué)儀器或直接肉眼觀察。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第21頁膠體金作為標識物應(yīng)用熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第22頁試孕紙熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第23頁熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第24頁應(yīng)用（定量）08天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院與天津市進出口檢驗檢疫局合作開發(fā)研發(fā)一個便攜式儀器。競爭法原理用于農(nóng)藥殘留定量檢測熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第25頁2鑭系元素鑭系元素又稱為稀土金屬元素，指元素周期表中原子序數(shù)57～71全部元素。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第26頁兩種不一樣鑭系元素離子(分別作為光吸收子和發(fā)射子)摻雜入亞微米尺寸陶瓷顆粒(作為主基質(zhì))中，會組成一類能上轉(zhuǎn)發(fā)光產(chǎn)生熒光特殊材料。——UCP(up-convertingphosphor，UCP)顆粒。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第27頁UCP顆粒主要含有以下三種成份:主基質(zhì)：氧硫化物（Y2O2S,GdO2S）、氟化物(YF3,GdF3）、硅酸鹽(YSi2O5,YSi3O7）...吸收子Yb3+Er3+Sm3+發(fā)射子Er3+Ho3+Tm3+

A2S1S2A1A3熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第28頁UCP獨特優(yōu)勢①高敏感性，有報道UCP靈敏度可達膠體金100倍。②高穩(wěn)定性，UCP發(fā)光信號不受檢測環(huán)境或樣品腐蝕或標志物本身衰變等影響，可長久存放和可重復(fù)。③使用簡便，安全無毒，可適合用于定量分析與多重分析，在普通試驗室或野外現(xiàn)場都可輕松應(yīng)用.熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第29頁中科院報道了一個用于免疫活性檢測UCP試紙條讀數(shù)計，采取半導(dǎo)體激光器作為光源，CCD作為光電接收器，步進電機帶動控制試紙條移動裝置UCP應(yīng)用舉例熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第30頁軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制出一個UPT十通道免疫層析試紙盤，同時檢測各種抗體以確證是否感染鼠疫菌熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第31頁霍亂弧菌—霍亂—烈性腸道傳染病甲胎蛋白(AFP）-肝癌特異性指標。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第32頁3量子點量子點(quantumdots，QDs)，主要指主族Ⅱ～Ⅵ(如CdSe)，Ⅲ～Ⅴ(如InP、InAs、GaSe)，副族化合物以及Si等元素組成納米顆粒熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第33頁①Q(mào)Ds有可準確調(diào)諧發(fā)射波長，經(jīng)過調(diào)整粒子尺寸可得到不一樣發(fā)射光譜，即可使用大小不一樣同種QDs顆粒實現(xiàn)不一樣顏色標識。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第34頁②較大Stokes位移和狹窄對稱熒光譜峰。使得用同一激發(fā)光源可同時激發(fā)不一樣大小量子點，產(chǎn)生不一樣發(fā)射光譜，使同時檢測多樣本成為可能。③QDs熒光性質(zhì)穩(wěn)定，可長久保留，經(jīng)受重復(fù)屢次激發(fā)。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第35頁④生物相容性好物理結(jié)合

化學(xué)偶聯(lián)熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第36頁量子點是一個新熒光標識物，當(dāng)前在免疫層析中得應(yīng)用相對UCP，膠體金較少見報道。張國華，賴衛(wèi)華等，量子點標識免疫層析試紙條快速檢測萊克多巴胺研究[J]，，以CdSe為標識物，對萊克多巴胺(一個苯酚胺類β-腎上腺素激動劑)快速定量檢測。胡華軍，付濤等，CdTe/ZnSe核殼量子點免疫層析試紙條檢測克倫特羅研究，,檢測克倫特羅(Clenbuterol，CLE)—屬于β-興奮劑類藥品,又稱“瘦肉精”量子點在免疫層析中應(yīng)用熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第37頁4有機納米粒子熒光素衍生物等熒光染料類有機納米粒子是早期慣用于免疫層析技術(shù)中一大類標志物，如異硫氰酸酯熒光素，標識原理基本都是利用熒光分子中異硫氰酸根為反應(yīng)基團，與蛋白分子中氨基結(jié)合，實現(xiàn)對蛋白標識，同時以分子中熒光素為檢測信號，早期應(yīng)用研究較多。有機納米粒子熒光發(fā)射依賴于粒子本身化學(xué)發(fā)光集團不含有沒有機納米粒子波長可調(diào)控尺寸效應(yīng)。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第38頁5納米磁性顆粒納米磁性顆粒(magneticnanoparticle，MNs)也被稱為超順磁顆粒，它結(jié)合了磁性粒子和納米材料優(yōu)點，含有粒徑小、超順磁性和比表面積大等特征。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第39頁經(jīng)典是以磁性材料四氧化三鐵.表面引入活性基團，經(jīng)過耦聯(lián)反應(yīng)與酶、抗體等生物分子結(jié)合形成生物標志物.超順磁性.熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第40頁6碳納米管碳納米管(carbonnanotubes，CNTs)結(jié)構(gòu)可看成是石墨六角形網(wǎng)格結(jié)構(gòu)發(fā)生一定彎曲而形成空間拓撲結(jié)構(gòu)。熒光免疫層析技術(shù)原理進展宣講專家講座第41頁CNTs作為生物分子標志物原理與膠體金類似，其顯著黑色在定