PTEN在血管重建早期作用第1頁/共13頁研究背景及目的磷酸酶PTEN是PI3K（磷脂酰肌醇-3-羥激酶）蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路的一種重要的生理學(xué)抑制劑，在過去的研究中，我們致力于研究在體內(nèi)和體外情況下PTEN在血管急性損傷后VSMC凋亡方面的作用。然而，PTEN在血管成形術(shù)誘導(dǎo)的血管損傷的早期階段的作用尚不明了。

為了明確該作用機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)以探究磷酸酶PTEN在早期血管重塑中的作用。第2頁/共13頁技術(shù)路線1.體內(nèi)(頸動(dòng)脈損傷模型構(gòu)建)2.體外：成年Wistar大鼠（300g)頸總動(dòng)脈分離未處理（對(duì)照）球囊損傷12h后PTEN表達(dá)量檢測(cè)取材（HcASMC）細(xì)胞培養(yǎng)至第六代干預(yù)24h轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染PTEN/活化的Akt突變體血清不同生長(zhǎng)因子周期性拉伸裝置H2O2WT-PTEN質(zhì)粒SiRNA敲出PTEN基因凋亡VSMC數(shù)量檢測(cè)、Akt磷酸化檢測(cè)VSMC凋亡數(shù)量檢測(cè)3.匯總數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、得出結(jié)論P(yáng)TEN表達(dá)量檢測(cè)第3頁/共13頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告：圖1A-D為了探究血管受損后PTEN的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況，研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠頸動(dòng)脈進(jìn)行球囊損傷，12小時(shí)后，免疫組化檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)如上圖：PTEN(green),apoptoticsmoothmusclecells(TUNELstaining,red)andnuclei(DAPI,blue）

由圖可知：球擴(kuò)后損傷較嚴(yán)重的區(qū)域PTEN表達(dá)量較多，正常細(xì)胞數(shù)量少、凋亡細(xì)胞數(shù)量密集（圖上半部分）第4頁/共13頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告：圖1E-Fwesternblot：usingaspecificPTENantibody微管蛋白

不同時(shí)間點(diǎn)PTEN相對(duì)表達(dá)量

densitometricanalysisofimmunoblots對(duì)經(jīng)/未經(jīng)球擴(kuò)后的標(biāo)本裂解后通過免疫沉淀反應(yīng)進(jìn)行PTEN活性檢測(cè)：ImmunoprecipitationsemployinganIgGiso-antibodyandwithoutadditionofanyantibodiesservedascontrols由圖可知：在大鼠頸動(dòng)脈受損后12H內(nèi)，PTEN的表達(dá)具有時(shí)間依賴性（遞增）與對(duì)照組相比，其活性明顯高于未受損的大鼠頸動(dòng)脈標(biāo)本。時(shí)間依賴性？第5頁/共13頁第6頁/共13頁第7頁/共13頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告：圖4A-CA:Proteinexpressionwasdeterminedbywesternblotting.DetectionofCdk4servedasaloadingcontrol.SMCtransfectedwithsiRNAtargetingPTENorascrambledcontrolwereincubatedinbasalmediumintheabsence(B)orpresenceofH2O2(C).SMCweretransfectedasfollows:nontransfected(NT);mocktransfected(withoutsiRNA,butwithlipidcarrier);transfectedwithanon-targeting(scrambled)siRNA(ControlsiRNA);transfectedwithatargetingsiRNAagainstPTEN(PTENsiRNA).由圖可知：與對(duì)照組相比，經(jīng)siRNA敲出PTEN基因之后，VSMC的PTEN表達(dá)量明顯減少，凋亡的SMC數(shù)量亦顯著減少。敲出PTEN基因后PTEN的表達(dá)及凋亡細(xì)胞數(shù)量變化第8頁/共13頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告：圖5A-CA：Akt磷酸化檢測(cè)（westernblot）AnantibodyagainsttotalAkt（PanAkt）wasusedascontrol.B:PI3-K-inhibitorLy294002(50nM)wassupplementedtothemediumfornot-transfectedcells.HcASMCweretransfectedasfollows:nontransfected(NT);transfectedwithaplasmidcodingforGFP(pGFP);transfectedwithanemptyplasmidwithoutPTEN-cDNA(pControl);transfectedwithaplasmidcodingforPTEN(pPTEN);mocktrans-fected(withoutplasmid,butwithtransfectionreagent).PTEN-andAktco-overexpressionreversesPTENsproapoptoticeffect(C).

注：GFP（綠色熒光蛋白）由圖可知：與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了PTEN質(zhì)粒的HcASMC其Akt磷酸化明顯減弱；在未轉(zhuǎn)染組中加入PI3K抑制劑（Ly294002）之后Akt磷酸化也明顯減弱；當(dāng)共轉(zhuǎn)染了PTEN質(zhì)粒和活化的Akt之后可以部分翻轉(zhuǎn)SMC凋亡。為了探究PTEN與Akt磷酸化及細(xì)胞凋亡的關(guān)系，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：第9頁/共13頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告：圖6A-BA：生長(zhǎng)培養(yǎng)基（FCS）培養(yǎng)條件下SMC增殖測(cè)定：PTENoverexpressionattenuatesserumInducedHcASMCproliferation(A).HcASMCtransfectedwithaplasmidcarryingWT-PTENoracontrolvectorcarryingGFPalonewereincubatedeitherinbasalmediumorgrowthmediuminthepresenceofBrdU.B:基礎(chǔ)/生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下SMC增殖測(cè)定：HcASMCweretransfectedasfollowing:transfectedwithanon-targeting(scrambled)siRNA(ControlsiRNA);transfectedwithatargetingsiRNAagainstPTEN(PTENsiRNA).由圖可知：與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了WT-PTEN質(zhì)粒后SMC增殖明顯減少，敲出PTEN基因后其增殖顯著增多且在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上表現(xiàn)更顯著。探究PTEN對(duì)SMC增殖的影響：第10頁/共13頁實(shí)驗(yàn)結(jié)論通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出如下結(jié)論：

通過對(duì)依賴PI3-K/Akt的生存信號(hào)的干擾，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的PTEN上調(diào)在損傷的頸