基因功能分析第1頁/共36頁第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于基因功能分析第二節(jié)基因打靶技術(shù)用于基因功能分析第三節(jié)反義RNA和RNAi抑制或沉默基因表達(dá)內(nèi)容概要第2頁/共36頁轉(zhuǎn)基因技術(shù)概念

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞染色體上，使轉(zhuǎn)基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮其功能的基因操作方法。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以制備轉(zhuǎn)基因生物或基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通常所指的轉(zhuǎn)基因生物是指將外源基因?qū)胧芫鸭?xì)胞或胚胎干細(xì)胞中，使外源基因通過隨機(jī)重組插入到受體細(xì)胞的染色體上，并隨細(xì)胞的分裂而將外源基因遺傳給后代。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)第3頁/共36頁第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因動物二、基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型第4頁/共36頁一、轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)

(一)概念應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因并能穩(wěn)定遺傳的動物。

(二)基本過程

1、轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建；2、將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞；3、將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠子宮內(nèi)；4、對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行鑒定。

第5頁/共36頁轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)基因報告基因增強(qiáng)子啟動子受精全能性細(xì)胞注射

植入假孕小鼠后代Southernblot

RT-PCRWesternblot轉(zhuǎn)基因小鼠第6頁/共36頁（三）轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用1、通過轉(zhuǎn)基因動物來研究特定基因在組織中特異表達(dá)或表達(dá)的時相；2、在活體內(nèi)研究或發(fā)現(xiàn)基因的新功能；3、可用于只在胚胎期才表達(dá)的基因結(jié)構(gòu)和功能研究；4、建立研究外源基因表達(dá)、調(diào)控的動物模型；5、遺傳性疾病的研究；6、建立人類疾病的動物模型，為人類的基因治療提供依據(jù)；7、動物新品種的培育；8、基因工程產(chǎn)品的制備；第7頁/共36頁1、不能將外源基因定向地插入受精卵細(xì)胞染色體的特定部位；2、外源基因隨機(jī)整合可能引起插入突變，破壞宿主基因組功能；3、外源基因隨機(jī)整合在宿主染色體上的拷貝數(shù)不同，可能出現(xiàn)不同表現(xiàn)型；4、整合的外源基因遺傳丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物癥狀的不穩(wěn)定遺傳。

（四）轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的問題第8頁/共36頁二、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞是一種最常用的細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)基因模型，外源基因通過轉(zhuǎn)基因過程插入到細(xì)胞染色體中，使外源基因可以作為細(xì)胞染色體的一部分得以在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞基本過程：1、真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：將外源基因和真核表達(dá)質(zhì)粒連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒；2、在原核細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增和克隆化真核重組表達(dá)質(zhì)粒；3、將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞；4、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆化篩選、保存；5、轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)目的蛋白、提取、鑒定。第9頁/共36頁第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于基因功能分析第二節(jié)基因打靶技術(shù)用于基因功能分析第三節(jié)反義RNA和RNAi抑制或沉默基因表達(dá)內(nèi)容概要第10頁/共36頁第二節(jié)基因打靶技術(shù)

基因打靶(genetargeting)是通過同源重組定向地從細(xì)胞染色體上移除或移入基因的過程。一般將定向移除基因的過程稱為基因敲除技術(shù)（geneknock-out），定向移入基因的過程稱為基因敲入（geneknock-in）；通過同源重組定向地在活體內(nèi)剔除特定基因的動物稱為基因敲除動物。目前基因敲除小鼠是應(yīng)用最廣泛的動物模型之一。第11頁/共36頁基因敲除載體的構(gòu)建第12頁/共36頁基因敲除小鼠建立流程示意圖(1)第13頁/共36頁基因敲除小鼠建立流程示意圖(2)第14頁/共36頁一、基因敲除技術(shù)的基本過程：1、打靶載體的構(gòu)建：一般包括三次DNA體外重組①、將待剔除基因作為目的基因克隆到特定克隆載體上；②、將帶有目的基因的重組載體作為克隆載體，利用合適的內(nèi)切酶將目的基因片段的大部分切除，使目的基因活性足以喪失，然后以此線性載體作為克隆載體，將一個陽性篩選標(biāo)志基因插入連接到目的基因的中段；例如；Neor基因：使細(xì)胞具有抵抗新霉素（G418）能力。第15頁/共36頁③、在目的基因外側(cè)線性化重組載體，并將一個陰性篩選標(biāo)志基因克隆到此。例如：單純庖疹病毒（HSV）的胸苷激酶的編碼基因為HSV-tk。當(dāng)它在細(xì)胞內(nèi)合成出胸苷激酶時，可以分解細(xì)胞培養(yǎng)液中加入的單核苷酸類似物而產(chǎn)生有毒的分解物使細(xì)胞死亡。這樣打靶載體包含了部分待剔除的基因片段、陽性篩選標(biāo)志基因、陰性篩選標(biāo)志基因。第16頁/共36頁

在特定基因剔除時，利用打靶載體上留下的部分待剔除的基因片段作為基因組上相同基因的同源臂，當(dāng)打靶載體與細(xì)胞基因組的同源基因發(fā)生同源重組時，打靶載體上的失活基因替代基因組上的基因，同時利用插入在基因同源臂之間的陽性、陰性標(biāo)志基因進(jìn)行鑒定。第17頁/共36頁2、將打靶載體導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中；胚胎干細(xì)胞通常取自小鼠胚胎早期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，該細(xì)胞能在體外培養(yǎng)，并保留發(fā)育的全能性。3、用陽性篩選標(biāo)志和陰性篩選標(biāo)志對轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行篩選。4、將發(fā)生同源重組的胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入小鼠胚泡中，然后將胚泡植入假孕小鼠子宮中；5、篩選嵌合體小鼠。通常同源重組一般只發(fā)在一條染色體上，可以用Neor基因作探針，通過Southernblot鑒定。6、雜交育種，獲得基因剔除的純合體小鼠第18頁/共36頁第三節(jié)利用基因沉默技術(shù)對基因功能進(jìn)行分析

結(jié)構(gòu)基因功能最終是通過其表達(dá)的蛋白質(zhì)來體現(xiàn)，因此結(jié)構(gòu)基因功能的研究可以在RNA水平上進(jìn)行，通過干預(yù)蛋白質(zhì)的翻譯過程或減少蛋白質(zhì)的產(chǎn)量來分析基因的功能。目前在RNA水平上分析基因功能的方法主要有兩類：一類是反義RNA技術(shù)封閉mRNA的功能；另一類是RNA干涉技術(shù)使基因處于沉默狀態(tài)。第19頁/共36頁一、反義RNA技術(shù)反義RNA技術(shù)是根據(jù)RNA序列人工合成的互補(bǔ)RNA。根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為三類：1、反義RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)或與靶mRNA直接結(jié)合形成雙鏈RNA，從而直接抑制mRNA的翻譯或被RNA酶Ⅲ識別降解。2、反義RNA是與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象的變化，從而抑制其翻譯。3、反義RNA是作用于基因的啟動子，直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。第20頁/共36頁二、RNA干涉

(RNAinterference，RNAi)第21頁/共36頁CraigC.Mello(1960-)UniversityofMassachusettsMedicalSchoolAndrewZ.Fire(1959-)StanfordUniversitySchoolofMedicineTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006

“fortheirdiscoveryofRNAinterference-genesilencingbydouble-strandedRNA”第22頁/共36頁RNAi廣泛存在于自然界隨后，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在被逐步闡明，而同時作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來越為人們所重視。

第23頁/共36頁

RNAi(RNA干擾):將與mRNA編碼區(qū)某段序列相對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默(表達(dá)受抑制)。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱為RNAi.1.RNAi(RNA干擾)的概念第24頁/共36頁2.RNAi的機(jī)制現(xiàn)有的RNAi作用機(jī)制模型包括兩個階段：1）起始階段

2）效應(yīng)階段第25頁/共36頁1）起始階段

dsRNA在Dicer酶（RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，屬內(nèi)切核酸酶）的作用下加工裂解21－23核甘酸長的小分子干擾RNA片斷，即siRNA（smallinterferingRNA）或shortinterferingRNAs）。siRNA是RNA干擾作用賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子，能提供一定的信息，允許一個特定的mRNA被降解。siRNA正義鏈與反義鏈各有21個堿基，其中19個堿基配對，在每條鏈的3’端都有2個不配對的堿基。

第26頁/共36頁2）效應(yīng)階段siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋并結(jié)合一個核酶復(fù)合物（該核酶復(fù)合物由內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白四種成分組成。），形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducesilencingcomplex,RISC）。在siRNA解雙鏈即RISC激活過程需一個ATP?；罨院蟮腞ISC定位到與siRNA中的反義鏈互補(bǔ)的靶mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。第27頁/共36頁

被切割后的斷裂mRNA隨即降解,從而使該基因的表達(dá)受抑,這就是轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(post-transcriptiongenesilencing,PTGS)。第28頁/共36頁第29頁/共36頁3.RNA干涉技術(shù)的基本過程1)、確定干涉靶點(diǎn)選擇目標(biāo)基因是進(jìn)行RNA干涉的第一步，根據(jù)靶基因序列，確定干涉的具體靶點(diǎn)。一般作為干涉的靶點(diǎn)序列應(yīng)具備：①、目標(biāo)RNA上被干涉的靶點(diǎn)應(yīng)盡量避開蛋白結(jié)合位點(diǎn)②被干涉的靶序列一般應(yīng)具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征，同時G：C比為50%左右③被干涉的靶序列應(yīng)該是特異性的，和其它RNA沒有同源性。第30頁/共36頁2)、雙鏈干涉RNA的合成；化學(xué)合成法；體外轉(zhuǎn)錄；表達(dá)載體3)、雙鏈干涉RNA對目標(biāo)RNA的干涉：首先，將干涉RNA轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞；其次，是對目標(biāo)RNA干涉程度進(jìn)行分析：可采用RT-PCR在RNA水平上監(jiān)測、Westernblot在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行監(jiān)測第31頁/共36頁

4.應(yīng)用研究基因功能的新工具已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。線蟲和果蠅的全部基因組序列已測試完畢，發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進(jìn)對這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，RNAi成為研究基因