外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測技術進展當前1頁，總共36頁。主要內(nèi)容循環(huán)腫瘤細胞檢測的意義循環(huán)腫瘤細胞檢測的基本原理納米材料技術在循環(huán)腫瘤細胞檢測中的應用微流控技術在循環(huán)腫瘤細胞檢測中的應用當前2頁，總共36頁。循環(huán)腫瘤細胞

（circulatingtumorcells,CTCs）1896年Ashworth在患者外周血中發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤細胞體積和形態(tài)相似的細胞；目前CTCs定義為自發(fā)或因診療操作脫離實體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進入外周血循環(huán)的一類腫瘤細胞。

AshworthTR.AustMedJ,1869,14:146-147AllardWJ,MateraJ,MillerMC,etal.ClinCancerRes,2004,10:6897-6904當前3頁，總共36頁。研究CTCs的臨床意義

TNM分期的重要補充療效監(jiān)測和預后判斷個體化治療的指導轉(zhuǎn)移復發(fā)的早期預警血循環(huán)轉(zhuǎn)移的機制當前4頁，總共36頁。TNM分期的重要補充基于解剖學特點的TNM分期存在許多不足CTCs可以做為TNM分期的重要補充2007年CTCs被ASCO推薦做為腫瘤標志物PantelK,etal.NatRevCancer.2008.8(5):329-40HarrisL,etal.JClinOncol.2007.25(33):5287-312CTCs的臨床意義當前5頁，總共36頁。療效監(jiān)測和預后判斷CTCs可以直接提示癌癥患者對治療的反應持續(xù)升高的CTCs提示腫瘤對治療反應差惡性腫瘤患者CTCs的出現(xiàn)均提示預后不良治療后CTCs出現(xiàn)與患者復發(fā)相關IgnatiadisM,etal.JClinOncol.2007.25(33):5194-202LiuMC,etal.JClinOncol.2009.27(31):5153-9RackBK,etal.JClinOncol.2010.28(15):1003HayesDF,etal.ClinCancerRes.2006.12(14Pt1):4218-24CristofanilliM,etal.NEnglJMed.2004.351(8):781-91CTCs的臨床意義當前6頁，總共36頁。個體化治療的指導個體化治療方案的制定根據(jù)病灶的生物學特性轉(zhuǎn)移灶的生物學特點與原發(fā)灶細胞存在差異針對CTCs的分析有助于為臨床治療提供個體化信息StoeckleinNH,etal.IntJCancer.2010.126(3):589-98Alix-PanabieresC,etal.ClinChem.2013.59(1):110-8Alix-PanabieresC,etal.AnnuRevMed.2012.63:199-215CTCs的臨床意義當前7頁，總共36頁。轉(zhuǎn)移復發(fā)的早期預警腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生發(fā)展的終末期，也是腫瘤病人死亡的主要原因目前常規(guī)檢測腫瘤轉(zhuǎn)移的方法主要影像學方法腫瘤轉(zhuǎn)移的早期發(fā)生在細胞水平即便高分辨率的影像學方法也無法偵測CTCs檢測可為潛在的轉(zhuǎn)移提供線索，為早期針對性治療提供可能CristofanilliM,etal.JAMA.2010.303(11):1092-3BuddGT,etal.ClinCancerRes.2006.12(21):6403-9CTCs的臨床意義當前8頁，總共36頁。血循環(huán)轉(zhuǎn)移的機制CTCs形成是血循環(huán)轉(zhuǎn)移的必經(jīng)步驟具有何種生物學特性的細胞容易轉(zhuǎn)移ChafferCL,etal.Science.2011.331(6024):1559-64PantelK,etal.TrendsMolMed.2010.16(9):398-406CTCs的臨床意義當前9頁，總共36頁。CTCs特點外周血含量低：1～10個CTC/mL血液﹠1個CTC/109

個血細胞；CTCs特性、形態(tài)及細胞標志隨著內(nèi)環(huán)境改變而改變，無統(tǒng)一鑒定標準。當前10頁，總共36頁。CTC的檢測步驟檢測富集當前11頁，總共36頁。以特異性抗體經(jīng)抗原抗體吸附篩選根據(jù)細胞大小進行富集免疫細胞化學結合納米材料物理學免疫學免疫/化學CTC富集方法當前12頁，總共36頁。免疫磁性分離陽性選擇法MACS、Cellsearch系統(tǒng)以及CTC-Chip陰性排除法CD45磁珠去除白細胞（IMB法）抗原抗體吸附篩選當前13頁，總共36頁。光鏡下(放大倍數(shù)400倍)免疫磁珠吸附目標細胞當前14頁，總共36頁。分子生物學方法(PCR)CTC檢測免疫細胞化學方法(ICC、EPISPOT)流式細胞技術當前15頁，總共36頁。

CellSearchTM（免疫磁珠技術）采用與細微鐵顆粒結合的抗體(鐵液)。鐵液特異性結合循腫瘤細胞，其強大的磁場把循環(huán)腫瘤細胞“牽引”出血樣，再用染色鑒定。CellTracks?AutoPrep?System當前16頁，總共36頁。CellSearch檢測CTCs流程圖當前17頁，總共36頁。1、不同腫瘤表面抗體的表達量存在差異2、腫瘤發(fā)展過程中細胞的去上皮化

CTC研究現(xiàn)狀當前18頁，總共36頁。磁珠體積很小，不損傷細胞、不影響細胞功能、不影響細胞的特異染色(細胞膜，細胞質(zhì)，細胞核)，顯微鏡下可直接觀察或計算機計數(shù)。前期應用微米磁珠，比表面積小、尺寸大、穩(wěn)定性差、易聚沉，致細胞分離效率低，難洗脫并保持細胞活性；檢測成本高、樣品用量多、樣品檢測時間長、檢測過程封閉等諸多不足．納米技術增大比表面積，分散性好，降低機械壓力，提高富集率

CTC方法學現(xiàn)狀當前19頁，總共36頁。納米技術納米科技是指在納米尺度(從單個原子、分子到亞微米尺度之間)上研究物質(zhì)特性和相互作用，以及由納米結構集成的功能系統(tǒng)。以此可獲得結構可控、表面功能化的納米材料和納米結構；納米材料具有一些獨特的效應，包括小尺寸效應、量子尺寸效應、界面效應以及宏觀量子遂道效應，使納米材料在性能上與具有相同組成的傳統(tǒng)概念上的微米材料有非常顯著的差異，表現(xiàn)出許多優(yōu)異的性能和全新的功能；納米技術增大比表面積，分散性好，降低機械壓力，提高富集率。當前20頁，總共36頁?；诜谴判约{米材料的CTC富集基于納米材料修飾表面將抗體功能化的不同形狀的納米材料(納米顆粒、納米線等)提高了細胞與捕獲靶點的接觸幾率、方便將CTC細胞從表面洗脫，減少納米顆粒吸附對于細胞活力和分析檢測的影響SekineJ,etal.AdvMater,2011,23(41):4788-4792ZhangN,etal.AdvMater,2012,24(20):2756-2760當前21頁，總共36頁?；诜谴判约{米材料的CTC富集基于納米結構表面腫瘤細胞和正常細胞在粗糙表面上具有不同的黏附特性，利用納米粗糙表面(如功能化的納米線、納米柱)分離血液中的CTC．ChenWQ,etal.ACSNano,2013,7(1):566-575當前22頁，總共36頁。HouS,etal.AdvMater,2013,25(11):1547-1551當前23頁，總共36頁。當前24頁，總共36頁。微流控技術微流控技術是一種針對極小量(10-9～10-18L)流體進行操控的系統(tǒng)科學技術;微流控芯片是微流控技術實現(xiàn)的主要平臺和技術裝置，其主要特征是容納流體的有效結構(通道、反應室和其他某些功能部件)至少在一個維度上為微米級尺度。當前25頁，總共36頁。2007年Toner在Nature報道他們開發(fā)的一套微流芯片系統(tǒng)----CTCschip

核心是在單晶硅表面蝕刻形成的微柱陣列，表面經(jīng)上皮細胞吸附分子（Anti-EpCAM）抗體進行修飾，對循環(huán)腫瘤細胞的選擇性吸附和捕獲被捕獲的細胞分布在微流芯片三維空間內(nèi)納米技術與微流控技術結合當前26頁，總共36頁。CTC-chips當前27頁，總共36頁。納米技術與微流控技術結合磁性納米材料與微流控結合用于CTC富集；非磁性納米材料與微流控結合用于CTC富集。當前28頁，總共36頁。磁性納米材料與微流控結合與CellSearchTM原理類似；微流控芯片的樣品量小、流速可控及構件透明；磁珠用量減少25%。當前29頁，總共36頁。非磁性納米材料與微流控結合第二代CTC-chips當前30頁，總共36頁。A)TheHB-Chipconsistsofamicrofluidicarrayofchannelswithasingleinletandexit.Insetillustratestheuniformbloodflowthroughthedevice.(B)Amicrographofthegroovedsurfaceillustratestheasymmetryandperiodicityoftheherringbonegrooves.Cartoonillustratingthecell-surfaceinteractionsin(C)theHB-Chip,and(D)atraditionalflat-walledmicrofluidicdevice.Flowvisualizationstudiesusingtwopairedstreamsofthesameviscosity(onestreamisgreen,theotherclear)demonstrate(E)thechaoticmicrovorticesgeneratedbytheherringbonegrooves,andthelackofmixingin(F)traditionalflat-walleddevices.舊方法:病人血液樣本通過一種表層涂有抗體的硅芯片，該抗體與腫瘤細胞結合，血液平滑流過microposts限制了與抗體覆蓋層的接觸。新方法：將血液標本經(jīng)過一個人字形溝槽，可快速混合液體，并產(chǎn)生一個更亂的血流，顯著增加捕獲細胞的數(shù)量。TonerM,etal.

ProcNatlAcadSciUSA.

2010，107(43):18392-7HB-chips當前31頁，總共36頁。BloodfrommetastaticprostatecancerpatientsandhealthydonorswasprocessedusingtheHB-Chip.(A)Healthydonors(n

=

10,redcircles)wereusedtoselectthesignalintensitythresholdinourautomatedimagingsystem(19).Themetastaticprostatecancerpatientdata(n

=

15,greencircles)hadsignificantlyhigherresults,with1415patientsamplespresentingCTCsabove-thresholdlevels.Additionally,(B)theTMPRSS2-ERGfusiontranscriptwasdetectedfromRNAisolatedfromtheHB-Chip,usingRT-PCR.SequencingofthegelbandidentifiedtheraregenefusionofTMPRSS2exon1andERGexon5.(C

and

D)MicrographsofCTCsisolatedfrompatientswithmetastaticprostatecancercostainedusingantibodiesagainstPSA(green),aleukocytemarker,CD45(red),andanuclearstain(DAPI).Correspondingmicrographsofthesamecellsareshowntotherightofthefluor