微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)四酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)詳解演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共31頁(yè)。優(yōu)選微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)四酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)當(dāng)前2頁(yè)，總共31頁(yè)。ELISA簡(jiǎn)介1971年瑞典學(xué)者Engvall和Perlmann，荷蘭學(xué)者VanWeeman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）當(dāng)前3頁(yè)，總共31頁(yè)。ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過(guò)程包被：將已知抗原或抗體通過(guò)物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色當(dāng)前4頁(yè)，總共31頁(yè)。ELISA檢測(cè)抗原

Ag+ Ab*Ag-Ab*當(dāng)前5頁(yè)，總共31頁(yè)。ELISA檢測(cè)抗體

Ab+ Ag*Ab-Ag*當(dāng)前6頁(yè)，總共31頁(yè)。ELISA檢測(cè)抗體(間接法)Ag+Ab1Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*Ag-Ab1-Ab2*當(dāng)前7頁(yè)，總共31頁(yè)。由于結(jié)合在抗原—抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個(gè)分子結(jié)合3～5個(gè)分子抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時(shí)又可結(jié)合3—5分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示，這是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。間接法比直接法靈敏當(dāng)前8頁(yè)，總共31頁(yè)。酶標(biāo)板當(dāng)前9頁(yè)，總共31頁(yè)。酶標(biāo)儀當(dāng)前10頁(yè)，總共31頁(yè)。一、ELISA法間接法檢測(cè)血清中HBsAb【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．熟悉ELISA的原理。2．了解免疫標(biāo)記技術(shù)的原理?！緦?shí)驗(yàn)原理】

采用純化HBsAg包被反應(yīng)板，加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入HBsAg-HRP。當(dāng)標(biāo)本中存在HBsAb時(shí)，就會(huì)形成HBsAg-HBsAb-HBsAg-HRP復(fù)合物，加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無(wú)顯色反應(yīng)。當(dāng)前11頁(yè)，總共31頁(yè)。將抗原HBsAg吸附于載體表面（廠家已經(jīng)完成）當(dāng)前12頁(yè)，總共31頁(yè)。將待測(cè)血清加入，溫育，血清中如有HBsAb，則抗原抗體結(jié)合當(dāng)前13頁(yè)，總共31頁(yè)。加入酶復(fù)合物，(HBsAg-HRP),酶復(fù)合物與表面抗體結(jié)合當(dāng)前14頁(yè)，總共31頁(yè)。加入酶的底物，酶與底物反應(yīng)，顯色當(dāng)前15頁(yè)，總共31頁(yè)。二、ELISA間接法檢測(cè)血清中HBsAg原理同檢測(cè)抗體,但小孔底部包被的為HBsAb酶復(fù)合物為:HBsAb-HRP當(dāng)標(biāo)本中存在HBsAg時(shí)，就會(huì)形成HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP復(fù)合物，加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無(wú)顯色反應(yīng)。當(dāng)前16頁(yè)，總共31頁(yè)?！緦?shí)驗(yàn)材料】1．乙肝病毒HBsAg（或HBsAb）酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。

預(yù)包被微孔條（用純化的單抗-HBs或純化HBsAg包被）酶結(jié)合物（多克隆抗-HBs-HRP或HBsAg-HRP）陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照洗滌液(濃縮液，用前以蒸餾水稀釋25倍)顯色劑A、B（一般為四甲基聯(lián)苯胺和H2O2）終止液（2mol/LH2SO4）。2．微量加樣器，吸水紙等。當(dāng)前17頁(yè)，總共31頁(yè)。①檢測(cè)HBsAg或HBsAb的反應(yīng)條②酶標(biāo)抗體③陰性對(duì)照血清④陽(yáng)性對(duì)照血清⑤洗滌液⑥顯色液(A,B)ELISA試劑盒包含以下各組分：當(dāng)前18頁(yè)，總共31頁(yè)。待測(cè)血清1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)注意：待測(cè)血清是從醫(yī)院采集的正常血清(人為加進(jìn)去乙肝表面抗原或者抗體)，但是并不表示血清中不含有可傳染的疾病，所以實(shí)驗(yàn)中要注意安全。當(dāng)前19頁(yè)，總共31頁(yè)。實(shí)驗(yàn)步驟每4人一組，每組有檢測(cè)HBsAg和檢測(cè)HBsAb的反應(yīng)條各一條,每條含6個(gè)反應(yīng)孔。每組有2種試劑盒(黃色測(cè)HBsAg,粉紅色測(cè)HBsAb),黃色試劑盒用黃色反應(yīng)條,粉紅色試劑盒用紅色反應(yīng)條。當(dāng)前20頁(yè)，總共31頁(yè)。3、檢測(cè)方法每孔加待檢血清50ul,每次實(shí)驗(yàn)各做1個(gè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照;本實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照孔不設(shè)，前面講臺(tái)上有空白的反應(yīng)條，可以作為空白對(duì)照。注意：每位同學(xué)選擇一種待測(cè)血清進(jìn)行檢測(cè)（見(jiàn)下圖）。當(dāng)前21頁(yè)，總共31頁(yè)。陰性陽(yáng)性待檢血清甲,乙,丙………….對(duì)照對(duì)照1號(hào)同學(xué)取待測(cè)血清1號(hào)…………..陰性陽(yáng)性待檢血清甲,乙,丙………….對(duì)照對(duì)照1號(hào)同學(xué)取待測(cè)血清1號(hào)2號(hào)同學(xué)取待測(cè)血清2號(hào)…………..2號(hào)同學(xué)取待測(cè)血清2號(hào)當(dāng)前22頁(yè)，總共31頁(yè)。(2)每孔加1滴酶結(jié)合物,充分混勻，37℃孵育30min(3)甩棄孔內(nèi)液體（在水池中甩棄，不要在實(shí)驗(yàn)室中隨地甩棄）；(4)每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩干。同上洗滌重復(fù)5次，拍干。當(dāng)前23頁(yè)，總共31頁(yè)。(6)每孔加顯色液A,B各1滴,充分混勻，置37℃15min.按以下方法,進(jìn)行肉眼觀察結(jié)果:

陰性對(duì)照孔無(wú)色,陽(yáng)性對(duì)照孔藍(lán)色;

待測(cè)孔顯藍(lán)色,為陽(yáng)性,否則為陰性。(7)加終止液（本實(shí)驗(yàn)不加終止液）當(dāng)前24頁(yè)，總共31頁(yè)。4結(jié)果記錄及結(jié)論陰性對(duì)照孔陽(yáng)性對(duì)照孔空白對(duì)照孔待測(cè)1待測(cè)2結(jié)果結(jié)論待測(cè)3待測(cè)4當(dāng)前25頁(yè)，總共31頁(yè)。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原體。在中國(guó)，HBV感染或攜帶者已超過(guò)1.3億，發(fā)病人數(shù)超過(guò)3000萬(wàn)人。HBV基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，其中有一個(gè)單鏈區(qū)。HBV的抗原組成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)組成。三種抗原具有其相應(yīng)抗體：HBsAb（抗表面抗原抗體）、HBeAb（抗e抗原抗體）、HBcAb（抗核心抗原抗體）。當(dāng)前26頁(yè)，總共31頁(yè)。HBsAg為二聚體糖蛋白，大量存在于感染者血液中，為HBV感染的主要標(biāo)志；HBcAg存在于Dane顆粒核心結(jié)構(gòu)表面，為內(nèi)殼成分，其外被HBsAg覆蓋，不易在血循環(huán)中檢出，但能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗-HBc，抗-HBcIgM的存在提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)；HBeAg游離于血中，其消長(zhǎng)與病毒體消長(zhǎng)及DNA多聚酶消長(zhǎng)基本一致，故HBeAg為HBV復(fù)制及具有強(qiáng)感染性的一個(gè)指標(biāo)；當(dāng)前27頁(yè)，總共31頁(yè)。HBeAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗-HBe能與受染肝細(xì)胞表面的HBeAg結(jié)合，通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)破壞受染肝細(xì)胞，抗-HBe的出現(xiàn)是預(yù)防后良好的象征。HBV的主要感染源是患者或無(wú)癥狀的HBsAg攜帶者，通過(guò)血液、體液、母嬰傳播。本實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)HBsAg及其抗體HBsAb當(dāng)前28頁(yè)，總共31頁(yè)。HBsAg（本實(shí)驗(yàn)測(cè)）HBeAg抗-HBs（本實(shí)驗(yàn)測(cè)）抗-HBe抗-HBc結(jié)果分析+----HBV感染或無(wú)癥狀攜帶者++---急慢性乙肝或攜帶者++--+“大三陽(yáng)”急慢性乙肝患者（傳染性強(qiáng)）+--++“小三陽(yáng)”急慢性乙肝感染，趨向于恢復(fù)--+++既往感染恢復(fù)期----+既往感染或“窗口期”--+--既往感染或接種過(guò)疫苗乙肝兩對(duì)半檢測(cè)的結(jié)果判斷方法當(dāng)前29頁(yè)，總共31頁(yè)?！咀⒁馐马?xiàng)】1．試劑盒應(yīng)于4℃存放，在有效期內(nèi)使用。2．微孔條須密封防潮，從冷藏環(huán)境中取出時(shí),應(yīng)在室溫中平衡