..生物制課及考試點錄ByAugustine藥學(xué)生技藥研中任1、物術(shù)物特〔1〕與源物接，性、毒低〔2〕穩(wěn)性，酶感在化道易解〔3〕分量大不穿胃黏膜〔4〕給途單；以射藥為，必頻給〔衰短2、物術(shù)物開趨研制新劑型提高穩(wěn)定性和生物活：如緩控釋微球、埋植劑、脂質(zhì)體、原位微球改變給藥途徑，即研究新的給藥統(tǒng)：如口服、鼻腔、肺部、直腸、透皮、眼部等途徑給藥提生利度方①藥進化修或成體物②用收進〔要③用抑劑④用子滲皮給。聚二修〔PEG修飾〕優(yōu)：以方延半期①為種障住白分外的原定，止體產(chǎn)生②PEG修飾，子量加腎小的過少③生間障保了白不被白水提多、白穩(wěn)性途定突干素個胱酸基化修修飾緩系添劑高解，止凝，，元冷枯、霧燥擬關(guān)應(yīng)〔pseudo-firstpasseffect鼻皮嗅區(qū)的胞素P450活性至于臟主由NADPH-胞素P450復(fù)酶量高約3~4倍，此此被謝產(chǎn)類肝處首作，稱擬首效〔pseudo-firstpasseffect。發(fā)現(xiàn)在鼻黏膜中也存在肝臟中的三類可誘導(dǎo)的細色素酶，在鼻上皮中也發(fā)現(xiàn)第Ⅱ相結(jié)合反活性。..word.zl.

125125.125125.蛋多一構(gòu)的PEST假設(shè)Roger等通文資的結(jié)現(xiàn)些在核胞快分的白分構(gòu)通含共的基序，即謂PEST假設(shè)該假設(shè)認為細胞內(nèi)半衰期短于2小時蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有一個或一個以上富脯氨酸P谷氨〔、氨酸S〕蘇酸〔T的域●這些富含的區(qū)域的兩側(cè)通?！驳豢偸恰秤袛?shù)個帶正電荷的氨基酸組。●所有的域的共同點是局部高度中的P、S或冬氨酸較少。PEST序能夠賦予蛋白多肽的快速分解確切機制尚未明然而，人們發(fā)現(xiàn)短壽的蛋白質(zhì)的分解需要的Arrhenius激活能〕為，壽蛋白的分解所需的Ea。這種不同提示存在2種分解通路，各具不同的速率限定性步驟PEST予蛋白一種快速降解的易感性，從而更易發(fā)生胞蛋白水解。蛋多類物代動學(xué)點〔〕著首效和小分子合成藥物相比類藥物口服具有十清楚顯的首關(guān)效應(yīng)類藥物在胃酸中的不穩(wěn)定性及胃腸道和肝臟普遍存在的蛋白水解酶達體循環(huán)前大量降解而致生物利用度極低大局部蛋白多肽類采用胃腸外給藥途徑注射給藥?！病吵ザ逃捎谶@類藥物體內(nèi)迅速降解原形藥物的體內(nèi)存留時間甚短衰期僅為數(shù)分鐘或0.5~1.0時左右，如胰島素在人體半衰期不到靜脈注射后1小時幾乎所有胰島素被去除，組織型纖溶酶原激活物〕半衰期為26-55，水蛭素為分鐘。這種短半衰期迫使它們在臨床應(yīng)時不得不采用靜脈滴注或?qū)掖晤l繁給藥效血藥水平?！病秤^布積常小這類藥物通常水溶性較強脂性較差過細胞膜和生理屏障數(shù)藥物的表觀分布容積相當(dāng)于細胞外液體積人體的表觀分布容積約為于細胞外液體積。這類藥物在血液中的濃度往往較，而在腦組織中的濃度較低?！病尘€動學(xué)質(zhì)蛋白多肽類藥物的吸收、結(jié)合和除均可能涉及非線性飽和動力學(xué)。腫瘤壞因子〕小鼠152mg.kg-1后曲線下面積分別為率分別為0.66、0.41和kg說明隨劑量增加，顯示非線性藥動學(xué)。..word.zl.

..獼猴靜脈注射重組單鏈尿激酶型溶酶原激活量增加而延長，時曲線下面積明顯于劑量的增加，全身去除率隨劑量增而減慢，提示研究劑量范圍內(nèi)可能涉及多酶反響，為劑量依賴性非線性動力學(xué)過程。聚二修1與蛋質(zhì)多分的必基團價合作一屏掩蛋質(zhì)子表抗決簇防抗產(chǎn)生同可改變物水液的物配為溶性減少藥的解2、PEG優(yōu)●身疫性低●醚造架難哺動降●PEG與蛋質(zhì)聯(lián)分質(zhì)增大不被臟謝反寡苷反寡苷類物人合的經(jīng)學(xué)飾寡苷片，通自特序與mRNA結(jié)合在因水上擾病白產(chǎn)。反義藥物能與特定的基因雜交因水平上干擾致病蛋白的產(chǎn)生擾遺傳信息由核酸向蛋白質(zhì)的傳遞。層的理層技是組關(guān)離法總當(dāng)別的合隨流相過定時由于組份理性存差，兩發(fā)相作〔附溶、合等的力同在相中分〔量照不，且流相前動各份斷地兩中展分，從到將組別的的層的類按定基的式柱析紙析薄層根流相形：相析氣層根原：子換親層、配析吸層、水析、膠濾層前白處主要是利鹽法、電沉、有溶沉等法的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。親層：依于白和的體ligand〕之的互用別的配通指的能另個..word.zl.

..分或子合一是共結(jié)〕分、團離、原子但親層中配體通共鍵與質(zhì)合配體以酶合一反物產(chǎn)或一可識靶白抗。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過裝有連接了體的基質(zhì)的親和層析柱時可以特異地與基質(zhì)結(jié)合沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)先被洗脫下來基質(zhì)上的靶蛋白最后可以用含有高濃度自由配體的溶劑洗下。以有時只用親和層析就可使蛋白質(zhì)的純化提高至。優(yōu)：純過程簡單、迅速離效率高驗條件溫和缺：針某一別離對象就需要制備專一的吸附劑和建立相應(yīng)的實驗條件基的選擇及其與基質(zhì)的共價結(jié)合需要煩瑣操作步驟根原：生專吸(bioselectiveadsorption)1.具專性和力生分對酶—物〔包括酶的競爭性抑制和輔酶因子〕特異性抗—體激素受體互補的凝集素和糖蛋白2.根過：固化Immobilise配基析中能被某一生大分子識別和可逆結(jié)合的生物專一性物質(zhì)?；|(zhì)載)親層析中與配基共價結(jié)使其固相化的物質(zhì)。載的擇應(yīng)備特：豐富的可供活化的化學(xué)基團，并在溫和條下能與配基共價結(jié)合。性的，非專一性吸附無或足夠小。孔網(wǎng)狀構(gòu)造。好的機械性能，具有好的液體流動性。較好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性?？蛇x的體瓊糖商品名型號：2B，4B，6B型號含義：瓊脂糖濃度為2%，4%，6%特：水強理性穩(wěn)，孔，專性附，能以態(tài)存經(jīng)起機溶處。..word.zl.

4848.聚烯胺膠商品名Bio-Gelp型號P-100型號含義：排阻限度X1000當(dāng)于允許進入凝膠內(nèi)部蛋白的最大分子量特：膠理性穩(wěn),抗生侵能力大適于基親物間和力擬的統(tǒng)應(yīng)防止pH2-11以外溶中期用葡糖膠商品名型號G-100,150,200型號含干凝膠吸水量特:理化質(zhì)定,耐、堿不酸,網(wǎng)小配的擇應(yīng)備特：于欲純化的生物物質(zhì)應(yīng)具有專一親和性須具備能被修飾的功能基團以酶和底物為例來討論配基與欲化的生物物質(zhì)的親和:KEL在親和層析定義分配系數(shù)Kd結(jié)/游離[EL]/[Ed00常數(shù)越小配基對大分子的親和力越和層析中就越有價值。K

一般為dm/mol太大洗脫回收困難，太小那么難于有效吸附目標(biāo)物質(zhì)。配基可以是小分子物質(zhì)：一些輔、輔基大分子物質(zhì)：酶、抗體純化酶的配底物、酶活性中心、抑制劑、輔酶、輔基等；純化抗原抗體的配基：互為配基純化核酸的配基DNA白質(zhì)和配的相固相化技術(shù)：將配基以共價鍵連于不溶于水的固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑過：化、接臂"入"""子配基適當(dāng)?shù)碾x開載體骨克制載體空間位阻的影響親層別〔〕柱平〔〕樣親吸操包括進料吸附、清洗、洗脫和再等步驟。..word.zl.

..洗脫方法有：特性脫利用含有與親和配基或標(biāo)產(chǎn)物具有親和作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過競爭性結(jié)合作用，脫附目標(biāo)物。特點：條件溫和，有利于保護目產(chǎn)物的活性和提高純度。非異洗：過調(diào)節(jié)洗脫液的、離子強度、離子種類或溫度等理化性質(zhì)降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和作用，使之脫附。是較多采用的洗脫方法。上：層析柱較短，通常左樣品液的濃度不宜過高上樣時流速比擬慢樣品緩沖液中有一定的的離子強上樣時選擇適當(dāng)較低的溫度特性脫優(yōu)：異性強，可以進一步消除非特異性吸附的響到較高的分辨率蛋白質(zhì)變性缺：常的時間、較大的洗脫條件。改方：擇親和力強的物質(zhì)洗脫、加大洗脫液濃度非異洗：與配體親和力較小連續(xù)大體積平衡緩沖液沖洗，不響活性，但洗脫體積較大，待別離物質(zhì)濃度較低。配體結(jié)合較強時適當(dāng)?shù)膒H離子強度洗脫，注意盡量不影響待別離物質(zhì)的活性與配體結(jié)合非常結(jié)實時使用較強的酸洗脫液中加脲性劑，使蛋白質(zhì)等待別離物質(zhì)變性，洗脫后再復(fù)性吸劑再和存再生大量的洗脫液或較高濃度的鹽溶液洗滌液重新平衡的不可逆吸附時，使用高濃度的鹽溶液、尿素變性劑或參加適當(dāng)?shù)姆菍Ｒ恍缘鞍酌副４妫簠⒓?.01%的疊氮化鈉下保存親膜一原利用親和配基修飾的微濾膜為親吸附介質(zhì)親和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的變形稱膜親和層析二應(yīng)及點應(yīng)：單克隆抗體的純化、葡萄6-酸脫氫酶G6PDH的純化等。..word.zl.

..特優(yōu)：傳質(zhì)阻力小，到達吸附平衡時間，配基利用率高；壓降小，流速高，設(shè)備體積小，基用量低。缺：理論板數(shù)很低，吸附和清洗效率；膜的污染會使操作速度、吸附效和親和膜的壽命下降。親錯過一原和作原：親和過濾或親超濾，是生物親和作用與膜別離相結(jié)合的蛋白質(zhì)類生物大分子的別離純化技術(shù)，是親和層的另一種變形。操：般包括進料吸附、清洗、洗脫和再生等步驟。親層用蛋質(zhì)離實免疫親和層析凝集素和糖蛋白親和層析含有輔酶的酶類的親和層析酶和蛋白類型抑制劑的親和層析肝素為配體的親和層析染料配體親和層析金螯層1、疫和析小鼠血清不同亞型IgG別離的ASepharoseCL-4B柱1.5mol/L的氨pH8.9(平衡小血清同等體積的平衡液釋后上柱洗去不吸附的蛋白質(zhì)用不同pH0.1mol/L檸酸洗脫2、集和蛋的和析離凝集素是在自然界廣泛存在的一類糖結(jié)合蛋白有不同的糖結(jié)合專一性天然存在的一些多糖和被固定化的不糖鏈構(gòu)造的糖蛋白，可以有效地別離純化不同型的凝集素，也可應(yīng)用固定化的凝集素別純化各種糖蛋白。用含有半乳糖的天然多脂糖的交聯(lián)產(chǎn)物別離天花粉凝集素..word.zl.

..用磷酸緩沖(含0.15mol/LNaCl)處理的天花粉的丙酮粉制劑用平衡液抽后，上柱洗去不吸附的雜蛋白用半乳糖溶液洗脫花粉凝集素3、有酶酶的和析很多的酶中都含有不同類型的輔，最為常見的是氧化復(fù)原酶和脫氫酶含有為此用固定化的以別離不同類型的氧還酶和脫氫酶，或激酶4、和白型制的和析一些酶其制間在非專的互用抑制劑被固定化以用于一些酶的別離純化。一些固定化酶也被應(yīng)用于蛋白類型的抑制劑的別離。為了防位現(xiàn)，在酶的小分子抑制劑固定化時，常插一不長的手〞如插入原子胰蛋白酶抑制劑的別離純化局部純化牛巢蛋酶制溶于的酸緩沖液流經(jīng)用同一緩沖液平衡固化胰白柱平衡液可洗去雜蛋白用的約1.2的溶(內(nèi)含和10mmol/LCaCl2)白酶抑制劑金螯層基蛋質(zhì)組酸唑和胱酸基與鋅離間成定螯物進別的..word.zl.

..影離交選性因素:1、合子徑半越，和力大2、子合：價子于吸附3、液pH：響換團交離的離度但影響換量4、子度越越；5、機劑不于附6、聯(lián)、脹、子：聯(lián)度，脹小篩能增；聯(lián)小膨度，吸量少7、脂粒間輔力除電力外還氫和德力輔力凝層的用脫別提測高子質(zhì)分量高子液濃蛋質(zhì)性究SDS定白分量原：蛋質(zhì)聚烯胺膠電時的遷率決它帶電以分的小形等素1967年，Shapiro等人現(xiàn)如在丙酰凝系統(tǒng)參陰子污十烷磺酸〔sodiumdodecylsulfate，簡SDS那蛋質(zhì)子的泳移主取于的分量而所電和狀關(guān)各SDS-Pr均一密度負荷其電過原Pr，除了同Pr荷差。參SDS，改了Pr的象SDS-Pr長圓，種軸為1.8nm。疏層疏作層〔HIC〕根分外疏性異別離白和肽生大子一較常的法疏性的質(zhì)在高離強的液被脫來當(dāng)離強降時，疏水強物質(zhì)隨被脫來最用正基交瓊糖膠更強疏作，些水較的白被附不解析苯-聯(lián)脂凝，用疏性強蛋質(zhì)根操：平Equilibration..word.zl.

..上Sampleapplication洗Washing洗Elution1、析的擇柱床高度通常為～15cm對一個優(yōu)化好的別離方案進展規(guī)放大時，可保持柱高不變，增加柱的直徑柱子〔內(nèi)徑為1.6～5.0cm進展層析。2、沖的擇往平衡的緩沖液和樣品中參加一鹽析鹽，有利于固定化配基與蛋白質(zhì)的相互作用。隨著鹽濃度的提高，結(jié)合到固定配基上的蛋白質(zhì)量也相應(yīng)提高。最用鹽Na、NaCl和(NH)244243、沖的擇隨著高，疏水作用相應(yīng)下降由于時，被中和的帶電基團增加，從而導(dǎo)致蛋質(zhì)的親水性增加在中性pH下與疏水相互作用介質(zhì)不結(jié)合的蛋白質(zhì)，在酸那么能夠結(jié)合4、白的脫低濃度的水溶性乙醇、去污劑和有鹽溶作用的鹽破壞水的構(gòu)造、降低外表從而削弱疏水相互作用。乙醇或去污劑的非極性區(qū)與結(jié)合蛋白質(zhì)競爭疏水性配基，從而將蛋白質(zhì)替代下來。5柱再、潔貯輕度污染時蒸餾水洗滌污染物嚴(yán)密結(jié)合時尿鹽酸胍洗滌＋起始緩沖液或貯存緩沖液洗滌NaO