關(guān)于大腸桿菌聚合酶的作用與應(yīng)用第一頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日大腸桿菌DNA聚合酶I的活性5’-3’DNA聚合酶活性15’-3’外切核酸酶活性23’-5’外切核酸酶活性3第二頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日5’-3’DNA聚合酶活性在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ使DNA鏈沿5‘→3‘方向延伸。3'Mg2+,dNTP5'

5'3'

DNA聚合酶I第三頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日5’-3’外切核酸酶活性從5'→3'方向水解DNA生長(zhǎng)鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5'-脫氧核苷酸。這種酶活性只對(duì)DNA上配對(duì)部分(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5'→3'。3'Mg2+5'

5'3'

DNA聚合酶I第四頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日3’-5’外切核酸酶活性由3’端水解DNA鏈，反應(yīng)底物是帶3'-OH的雙鏈DNA或單鏈DNA，其活性從3'-OH端降解ds-DNA，可被5'3'聚合活性封閉，也可被帶5'磷酸的dNMP抑制5'Mg2+

Mg2+,dNTP3'3'5'DNA聚合酶IDNA聚合酶I第五頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日活性能發(fā)生的反應(yīng)切口平移置換反應(yīng)活性第六頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日置換反應(yīng)如果只有一種dNTP存在，3'5'外切核酸活性將從3'-OH端降解DNA，而5'3'聚合酶活性又在合成DNA，然后在該位置發(fā)生一系列的合成和外切反應(yīng)，直到露出與該dNTP互補(bǔ)的堿基。

3'5'外切酶活性5'3'

5'3'聚合酶活性第七頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日切口平移首先在鎂離子存在下用少量DNaseI處理雙鏈DNA模板，產(chǎn)生少量切口。在切口處利用大腸桿菌DNA聚合酶I的5’-3’外切核酸酶活性是切口沿5’-3’方向移動(dòng)，同時(shí)5’-3’DNA聚合酶活性又不斷合成DNA。

5'

Mg2+DNaseI

3'

5'

dNTP大腸桿菌DNA聚合酶I

3'

第八頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日應(yīng)用13’-端的末端標(biāo)記2切口平移法標(biāo)記DNA3合成cDNA的第二鏈第九頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日3’-端的末端標(biāo)記先用此酶的3’→5’核酸外切酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；在以其5’→3’聚合酶活性使其使其補(bǔ)平，在高濃度dNTP的條件下，3’-端的外切反應(yīng)與dNTP的攙入反應(yīng)達(dá)到平衡。若dNTP中有放射性標(biāo)記的核苷酸，即可使產(chǎn)物成為3’-末端的帶標(biāo)記的DNA。第十頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日切口平移法標(biāo)記DNA在Dnase的作用的基礎(chǔ)上產(chǎn)生連內(nèi)切口，應(yīng)用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性的同步聯(lián)合反應(yīng)，使切口沿DNA鏈從5’-端向3’-端移動(dòng)。若用聚合反應(yīng)的原料dNTP帶有放射性核素α-32P，就能使生成的雙鏈帶有標(biāo)記物。根據(jù)此原理可做DNA雜交探針。第十一頁(yè)，共十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日合成cDNA的第二鏈

單鏈cDNA3’-端可形成