SequenomSNP驗過程說明文件目錄一、實驗基本流程及原理二、實驗過程1、引物設計2、提取3、擴增(34、產物堿性磷酸酶處理(35、單堿基延伸6、樹脂純化7、芯片點樣8、質譜檢測三、附錄實驗所需的試劑、耗材和儀器設備一、實驗基本流程及原理

SequenomMassARRAY?SNP測過程結合多重PCR術、MassARRAYiPLEX單堿基延伸技術和基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析質譜技術(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationof進行分型檢測。將包含位點區(qū)域的模板通過技術擴增再使用特異的延伸引物與PCR物進行單堿基延伸反應。由于多態(tài)性位點堿基不同,延伸產物不同的末端堿基將導致延伸后的產物分子量的差異,因此由SNP多態(tài)性引起的堿基差異通過分子量的差異而體現,過基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析質譜技術檢測延伸產物分子量的大小,用專用的分析軟件通過判斷分子量的差異而進行分型檢測。檢測實驗基本步驟如下圖所示圖1MassARRAY?SNP檢測實驗基本步驟二、實驗過程1、引物設計

使用Sequenom司GenotypingTools軟件設計待測位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物并交由生物公司合成。2、提取使用WizardGenomicpurificationKit或(MN等試劑盒或類似產品,取組織、細胞或血樣中的DNA。用分光光度計定量瓊脂糖凝膠電泳質檢,因組DNA泳條帶通常不小于。質檢合格的將濃度調整到轉移至孔板,-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

℃4、產物堿性磷酸酶處理(1反應結束后,將產物用SAP(shrimpalkaline蝦堿性磷酸酶處理,以去除體系中游離的dNTPs。(2制堿性磷酸酶處理反應液,Mix。(3用24通道加樣器調節(jié)加樣體積為2μL,將SAPMix入孔反應板。

(4384孔板放置在兼容孔板的PCR儀上設定反應條件I.for30secondsII.CforsecondsIII.forsecondsIV.Cfor5secondsGOTOIII,

VI.GOTOII,VII.CforVII.4oCforever啟動PCR進行單堿基延伸反應。6、樹脂純化(1Clean樹脂平鋪到6mg的樹脂板中;(216μl水到延伸產物的對應孔內;(3干燥后的樹脂倒入延伸產物板中封膜低速垂直旋轉分鐘,使樹脂與反應物充分接觸;(4心使樹脂沉入孔底部。7、芯片點樣啟動RS1000樣儀將樹脂純化后的延伸產物移至384孔芯片上。8、質譜檢測將點樣后的芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaserdesorption/–timeof基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析,檢測結果使用TYPER軟件(sequenom型并輸出結果。三、附錄實驗所需的試劑、耗材和儀器設備關鍵試劑CodeManufacturerCatNo.

1CompleteGoldGenotypingSetSequenom10148-2關鍵儀器CodeManufacturer1S1000TMThermalBIORAD2singlechannelEppen