基因工程基本知識及基本技術(shù)第1頁/共163頁

掌握基因的結(jié)構(gòu)，基因表達(dá)的概念、過程及操縱子學(xué)說；掌握DNA的分離與純化、電泳技術(shù)及PCR技術(shù)；了解核酸分子雜交、DNA序列分析技術(shù)和基因突變技術(shù)。重點與難點乳糖操縱子模型；電泳技術(shù)、PCR技術(shù)、核酸分子雜交、DNA序列分析。教學(xué)目標(biāo)與要求教學(xué)要求需掌握專業(yè)詞匯operator；SDsequence；基因表達(dá)；結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因；基因組(genome)；分子雜交；基因突變；多順反子；Southernblotting；Northernblotting；meltingtemperature(Tm)。第2頁/共163頁基因：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列，由結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因組成。結(jié)構(gòu)基因：轉(zhuǎn)錄成各種RNA直接行使功能；轉(zhuǎn)錄成mRNA，翻譯成功能蛋白質(zhì)。調(diào)節(jié)基因：

調(diào)節(jié)或限制其他基因活性的基因，如啟動子，增強子，終止子等。1.1基因工程的基礎(chǔ)知識

1.1.1基因的結(jié)構(gòu)特點第3頁/共163頁DNA

1）結(jié)構(gòu)簡練（基因組小，DNA含量少）

2）大多用于編碼蛋白質(zhì)

3）形成功能單位或轉(zhuǎn)錄單元，多順反子

4）有重疊基因mRNA

1）半衰期短2）以多順反子形式存在

3）存在SD序列原核生物基因結(jié)構(gòu)特點細(xì)菌mRNA起始密碼子AUG上游10個堿基左右處，富含嘌呤的堿基序列，能與細(xì)菌16SrRNA3’端識別，幫助從起始AUG處開始翻譯。

第4頁/共163頁DNA

1）不連續(xù)性（內(nèi)含子，外顯子）連接區(qū)為高度保守和特異的堿基序列

2）高度重復(fù)序列衛(wèi)星DNAmRNA

1）5′帽子結(jié)構(gòu)

2）具ploy（A）尾3）單順反子真核生物基因結(jié)構(gòu)特點第5頁/共163頁就是基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程。在一定調(diào)節(jié)機制控制下，大多數(shù)基因經(jīng)歷基因激活、轉(zhuǎn)錄及翻譯等過程，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子。但并非所有基因表達(dá)過程都產(chǎn)生蛋白質(zhì)，編碼tRNA、rRNA基因轉(zhuǎn)錄合成RNA的過程也屬于基因表達(dá)。Geneexpression定義：1.1.2基因表達(dá)第6頁/共163頁轉(zhuǎn)錄與翻譯幾乎同時發(fā)生，表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。

RNA聚合酶（RNApolymerase）的作用是轉(zhuǎn)錄RNA。原核生物RNA聚合酶有比較復(fù)雜的亞基結(jié)構(gòu)。如大腸桿菌RNA聚合酶有四條多肽鏈，另有一個促進(jìn)新RNA分子合成的σ因子，因此它的組成的是α2ββ’σ。這種結(jié)構(gòu)稱為全酶（holoenzyme），除去了σ因子的酶稱為核心酶。

σ因子，識別DNA上的啟動子，提高聚合酶與啟動子的親和力。原核生物基因表達(dá)第7頁/共163頁真核生物基因表達(dá)第8頁/共163頁

Jacob和Monod對大腸桿菌乳糖代謝機制研究發(fā)現(xiàn)，某些基因只起調(diào)節(jié)或操縱作用，于1961年提出了乳糖操縱子模型，開創(chuàng)了基因表達(dá)調(diào)節(jié)機制研究的新領(lǐng)域。操縱子：基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位，有共同的控制區(qū)和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。包括在功能上彼此有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和控制部位。乳糖操縱子：阻遏子I

啟動子O

操縱子P

結(jié)構(gòu)基因Z、Y、A

1.1.3操縱子學(xué)說第9頁/共163頁乳糖操縱子基因表達(dá)調(diào)控模型第10頁/共163頁原核生物基因表達(dá)的調(diào)控

Ｒ

Ｐ

Ｏ

lacZlacY

lacA調(diào)節(jié)基因啟動子操縱基因結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶信使RNA轉(zhuǎn)錄翻譯阻抑物與乳糖結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生了改變，因而不能與操縱基因結(jié)合，使得結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。阻抑物乳糖轉(zhuǎn)錄半乳糖苷酶透過酶乙酰基轉(zhuǎn)移酶乳糖分解代謝調(diào)控過程是一個自我調(diào)控過程

乳糖代謝基因表達(dá)調(diào)控圖解（有乳糖時）第11頁/共163頁代謝產(chǎn)物對基因活性的調(diào)節(jié)可誘導(dǎo)：乳糖操縱子可阻遏：色氨酸操縱子操縱子調(diào)節(jié)的類型負(fù)調(diào)節(jié)：細(xì)胞中存在抑制物，使轉(zhuǎn)錄處于關(guān)閉狀態(tài)。正調(diào)節(jié)：一個效應(yīng)分子激活啟動子。降解物對基因活性的調(diào)節(jié)代謝物調(diào)節(jié)的基因活性操縱子學(xué)說的核心：基因人表達(dá)抑制狀態(tài)中解脫出來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，是從負(fù)調(diào)節(jié)角度來考慮基因表達(dá)調(diào)控的。第12頁/共163頁密碼子道生一，一生二，二生三，三生萬物1.1.4基因研究進(jìn)展第13頁/共163頁信息流新陳代謝是物質(zhì)與能量流動推動物質(zhì)流動的是能量動力物質(zhì)如何流動？信息決定第14頁/共163頁前者是可以轉(zhuǎn)錄成各種RNA，或者轉(zhuǎn)錄成信使RNA然后翻譯成多肽鏈，最終形成各種功能蛋白質(zhì)和酶；后者指一類能夠調(diào)節(jié)或限制其他基因活性的基因。管家基因和奢侈基因

具有相同遺傳信息的個體細(xì)胞其所利用的基因并不相同，有的基因活動是維持細(xì)胞基本代謝所必需的，而有的基因則在一些分化細(xì)胞或受到外界刺激的細(xì)胞中活動。前者為管家基因（house-keepinggene），如編碼核糖體蛋白、線粒體蛋白、糖酵解酶等的基因；后者為奢侈基因（luxurygene），如胰島素中的β細(xì)胞合成胰等。結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因第15頁/共163頁移動基因可移動的遺傳因子。如：轉(zhuǎn)座子，它能從一個位點轉(zhuǎn)座到另一個位點，或從一個復(fù)制子轉(zhuǎn)座到另一個復(fù)制子。重疊基因不同基因間存在互相共用的核苷酸序列，這樣的基因稱為重疊基因（overlappinggenes）?；蚪M（genome）一個生物體、細(xì)胞器或病毒的全部基因。第16頁/共163頁假基因討論假東西假幣假牙有其形無其能進(jìn)化的中間體基因還在進(jìn)化發(fā)展第17頁/共163頁作業(yè)如何理解中心法則基因概念管家基因奢侈基因假基因基因組第18頁/共163頁

由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實驗條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。1.2基因工程的支撐技術(shù)1.2.1DNA的提取與純化第19頁/共163頁GenomicDNAplasmidDNAThegenomicDNAofE.coli：asinglecirculardouble-strandedDNA，withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell。

1.2.1.1質(zhì)粒DNA的提取第20頁/共163頁閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復(fù)性快；原理DNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強堿中性堿抽提法提取質(zhì)粒DNA第21頁/共163頁

染色體線性DNA或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。變性第22頁/共163頁①

溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。1）所用的試劑及作用第23頁/共163頁③EDTA

Mg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNase的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDS

NaOH：強堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。

SDS：溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白—SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。第24頁/共163頁冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。用來中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥

乙醇

DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。⑤NaAc-HAc緩沖液第25頁/共163頁⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作；

EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。第26頁/共163頁液體蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀，但苯酚會殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA）。⑨

酚-氯仿選用以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。第27頁/共163頁SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。①溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA，4mg/ml～5mg/ml溶菌酶，RNaseA2）堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟第28頁/共163頁溶液II

破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。②破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性SolutionII的配制：③中和液體溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。液體SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）第29頁/共163頁上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。④離心除去沉淀

0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。⑤純化DNA上清液過柱或酚-氯仿抽提。⑥沉淀DNA第30頁/共163頁最重要的是：菌株的遺傳背景，質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。①受體菌株

endA基因編碼核酸內(nèi)切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片斷。3）影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素第31頁/共163頁這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。③質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。②質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。第32頁/共163頁1）細(xì)胞裂解10%SDS和蛋白酶K，37℃溫育，不用NaOH!2）DNA純化

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。1.2.1.2細(xì)菌基因組DNA的制備第33頁/共163頁動物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。

組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。1）組織粉碎2）細(xì)胞裂解0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K，50℃溫育。

SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。1.2.1.3哺乳動物細(xì)胞基因組DNA的抽提第34頁/共163頁3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。5）除去RNA污染用RNase。用2倍體積的無水乙醇。4）沉淀DNA（可以加入1/10體積的3M醋酸鈉輔助沉淀）第35頁/共163頁1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。2）細(xì)胞裂解用2%CTAB/2-ME（十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）?；?%SDS和蛋白酶K，65℃溫育。1.2.1.4從植物組織中制備

DNA第36頁/共163頁用0.6倍體積的異丙醇（-20℃）。3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。4）沉淀DNA5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）。第37頁/共163頁1）紫外光譜法

DNA（或

RNA）在260nm波長處有特異的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度計直接測定。原理：蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰1.2.1.5DNA的定量和純度測定第38頁/共163頁蛋白核酸定量測定儀第39頁/共163頁溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)紅色熒光。原理：與已知濃度的DNA電泳帶熒光強度對比，就可以估計出DNA含量。瓊脂糖凝膠電泳估計第40頁/共163頁一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對比得知。

DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。Marker1.2.1.6DNA分子量的估計第41頁/共163頁DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarker第42頁/共163頁1.2.2

電泳技術(shù)水平電泳槽第43頁/共163頁基本原理帶電荷的分子在電場中會以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動，速度稱為電泳遷移率。電泳遷移率同電場的強度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。

第44頁/共163頁如果電場強度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）：分子在電場中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀。形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān)：分子量越大，移動越慢。摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關(guān)。第45頁/共163頁Relaxed

supercoiled

Increasingdegreeofsupercoiling

相同分子量的DNA：閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開環(huán)狀最慢。第46頁/共163頁第47頁/共163頁1.2.2.1瓊脂糖凝膠電泳1）瓊脂糖2）瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。濃度高，空隙小。第48頁/共163頁瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片斷大?。╞p）0.30.71.450000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子較易通過，而大分子難通過；空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。3）瓊脂糖凝膠的分辨力空隙大小決定其分辨分子大小的能力。第49頁/共163頁4）低熔點膠（LMP）

熔點為62-65℃，可在37℃下保持液體狀態(tài)數(shù)小時，25℃下保持10分鐘。低熔點瓊脂糖回收DNA直接進(jìn)行酶切處理5）電泳所用溶液

TBE（5Χ）緩沖液：Tris-Base，硼酸，EDTA-Na2加樣緩沖液：溴酚藍(lán)，蔗糖水溶液第50頁/共163頁

EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。

EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強度與DNA含量及大小成正比。②原理Ethidiumbromide（EB）①

染料溴化乙錠6）凝膠染色第51頁/共163頁

第52頁/共163頁第53頁/共163頁UVP全自動凝膠成像分析系統(tǒng)第54頁/共163頁OMEGA8-LOGO全自動凝膠成像分析系統(tǒng)第55頁/共163頁垂直電泳槽1.2.2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳第56頁/共163頁特點優(yōu)點是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。實用于蛋白質(zhì)分離分析及DNA序列測定。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大小（bp）4.010.020.01000—100500—2550—1比較：瓊脂糖凝膠電泳：200～50000bp聚丙烯酰胺凝膠電泳：1～1000bp第57頁/共163頁1）SDS電泳所用溶液單體母液丙烯酰胺30.00g、甲叉雙丙烯酰胺0.80g、ddH2O定容至100mL，定性中速濾紙過濾，棕色試劑瓶4℃存放。分離膠緩沖液（4×，pH8.80）

Tris-Base（1.5mol/L）18.17g，10％（w/v）SDS4mL，濃HCl調(diào)節(jié)pH值為8.8，定容至過濾100mL，4℃存放。第58頁/共163頁濃縮膠緩沖液（4×，pH6.80）

Tris-HCl（0.50mol/L）6.06g，10％（w/v）SDS4mL、加80mLddH2O溶解，用濃HCl調(diào)pH值為6.80，定容到100mL，4℃存放。電極緩沖液（pH8.30）

Tris-Base6.1g、甘氨酸28.9g、ddH2O溶解定容至500mL。第59頁/共163頁樣品緩沖液（2×）：濃縮膠緩沖液25mL、SDS（固體干粉）2g、甘油10mL、溴酚蘭20mg、ddH2O溶解定容至50mL，室溫保存。10％的過硫酸銨：過硫酸銨0.10g、ddH2O1.00mL、4℃密閉存放。染色液（1000mL）：考馬斯亮蘭R-2502.5g、甲醇454mL、冰醋酸92mL、水454mL。脫色液（1000mL）：甲醇456mL、冰醋酸72mL、水472mL。除染液和脫色液外，均要冷凍或冷藏！第60頁/共163頁分離膠與濃縮膠配方示例分離膠（12％）體積濃縮膠（5％）體積單體母液（mL）9.60單體母液（mL）0.75ddH2O（mL）8.40ddH2O（mL）3.00分離膠緩沖液（mL）6.00濃縮膠緩沖液（mL）1.2510％APS（μl）10010％APS（μl）40TEMED（μl）36TEMED（μl）12總體積（mL）12總體積（mL）5第61頁/共163頁Marker第62頁/共163頁基因擴增（geneamplification）指在生物體內(nèi)或體外采用人工方式使基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。有下列五種方式：1.環(huán)境誘發(fā)擴增2.基因的程序性擴增5.PCR擴增3.基因組進(jìn)化擴增4.基因工程擴增1.2.3聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)第63頁/共163頁1.環(huán)境誘發(fā)擴增如氨甲喋呤誘發(fā)二氫葉酸還原酶基因擴增。在環(huán)境因子的誘發(fā)下，某些基因產(chǎn)生明顯的擴增。在發(fā)育的某個階段，某些基因的大量擴增。2.基因的程序性擴增如非洲爪蟾卵子形成過程中rRNA基因的擴增。第64頁/共163頁生物進(jìn)化過程中基因組中某些基因的拷貝數(shù)增加，結(jié)果相關(guān)的基因聚集成簇。5.PCR擴增應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)，在體外特異性地擴增某個基因。3.基因組進(jìn)化擴增4.基因工程擴增載體攜帶目的基因在寄主細(xì)胞中大量復(fù)制。第65頁/共163頁Mullis由此獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。1985年Cetus公司的科學(xué)家K.B.Mullis發(fā)明了PCR，使這一設(shè)想變成現(xiàn)實。1971年Khorana提出體外人工復(fù)制DNA的設(shè)想。當(dāng)時由于引物和DNA聚合酶及DNA測序技術(shù)都沒有解決，設(shè)想未能實現(xiàn)。1.2.3.1PCR技術(shù)的發(fā)明第66頁/共163頁TheNobelPrizeinChemistry1993第67頁/共163頁TaqDNA聚合酶

1988年

R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反應(yīng)中，使

PCR自動循環(huán)儀成為可能。PCR儀1988年

Cetus公司發(fā)明自動熱循環(huán)儀。

1986年

H.A.Erlish從嗜熱水生菌分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37℃），PCR技術(shù)才進(jìn)入實用階段。第68頁/共163頁第69頁/共163頁模板DNA變性引物和DNA復(fù)性引物DNA延伸1.2.3.2PCR技術(shù)的原理第70頁/共163頁雙鏈DNA在受熱后，配對堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開成為單鏈。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

TAGAACTTGACGTACGTA95℃模板模板（template）①DNA模板變性第71頁/共163頁TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

人工合成的單鏈DNA小片斷，堿基順序分別與所要擴增的模板DNA雙鏈的5’端相同。模板模板ATCTTGAAC5’

3’

ACGTACGTA5’

3’

引物引物引物（primer）：40℃～65℃②DNA模板與引物復(fù)性第72頁/共163頁DNA聚合酶按堿基配對原則在模板上延伸DNA鏈。TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

模板模板ATCTTGAAC5’

ACGTACGTA5’

TaqTaq72℃③DNA鏈的延伸第73頁/共163頁理論上25～30次循環(huán)就可以合成225～230條DNA。變性—復(fù)性—延伸。⑤新一輪循環(huán)開始④1個循環(huán)的結(jié)果第74頁/共163頁反應(yīng)體系示例：在0.5mlEP管中依次加入以下成分：1.2.3.3PCR過程加礦物油30ul于反應(yīng)混合物表面，以防止加溫過程中液體蒸發(fā)。

10×PCR緩沖液5μl；MgCl２

3μl；dNTP4μl；引物12μl；TaqDNA聚合酶0.5μl；引物22μl；HaSNPV基因組DNA1μl；ddH2O補至50μl。第75頁/共163頁①引物的濃度高；②引物的鏈短。50℃

～60℃下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復(fù)性。②復(fù)性（anneal）①變性（denature）

94℃～95℃下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。反應(yīng)過程第76頁/共163頁

94℃下1min，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。④變性（denature）⑤重復(fù)（repeat）

72℃下1min～2min，TaqDNA聚合酶在引物的3’端上加上核苷酸。③延伸（extend）第77頁/共163頁第78頁/共163頁需要的模板量極低。1）特異性強

①PCR使用專門合成的DNA引物。②延伸過程是在高溫下進(jìn)行。2）敏感性高

這就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA，提高了反應(yīng)的特異性。理論上只要一條模板鏈，32次循環(huán)就可合成約109條！1.2.3.4PCR的特點第79頁/共163頁

RT-PCR：先用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行擴增。對模板的純度要求低。5）可以擴增mRNA4）簡便

3）快速

整個PCR過程約4小時即可完成。不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。第80頁/共163頁

H.A.Erlish分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37℃），PCR技術(shù)才進(jìn)入實用階段。1.TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶的最大特點是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過程的反復(fù)高溫變性要求。1）熱穩(wěn)定性1.2.3.5影響

PCR的因素第81頁/共163頁最適溫度：

75℃

～80℃最長延伸長度：6.7kb2）最適溫度高3）Taq酶的功能缺點具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但沒有3‘5’外切酶活性。因此不能修復(fù)錯誤的堿基配對！

合成超過600bp長度的DNA就有可能出現(xiàn)錯配，一般PCR中出錯率為2×10-4

核苷酸/每輪循環(huán)。用于克隆基因時必須測序。，第82頁/共163頁金屬離子敏感（尤其是Mg2+

）。當(dāng)dNTP（能結(jié)合Mg2+）的濃度為0.7～0.8mmol/L時：

MgCl2的最佳濃度應(yīng)是2.0mmol/L。4

）TaqDNA聚合酶的激活劑50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。Taq的PCR產(chǎn)物3’端往往帶有一個A。第83頁/共163頁1）TthDNAPolymerase無3’5’DNA外切酶活性，但高溫下能逆轉(zhuǎn)錄cDNA，又能擴增DNA。2）VENTDNAPolymerase有3‘5’外切酶活性，能夠校正堿基的錯配。能耐受100℃高溫。2.其它耐熱的

DNA聚合酶第84頁/共163頁3）PfuDNAPolymerase4）TaqPlusDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。但PCR產(chǎn)物為平端！

是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA聚合酶中出錯率最低的。是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。

第85頁/共163頁與待擴增的模板DNA區(qū)段的兩3’端序列互補（

5‘端相同）的短DNA。1）位置3’

3’

2）引物的長度一般引物設(shè)計為長15bp～30bp。太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費，且難以合成。

3.引物（primer）第86頁/共163頁3）引物的堿基序列

5’端根據(jù)需要可設(shè)計成某個內(nèi)切酶的切點順序、RNA聚合酶識別序列、突變位點或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3’端必須與模板正確配對，5’端可以不配對。templateprimer第87頁/共163頁盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力，G+C含量通常為40%-60%。4）引物的堿基組成避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列。

5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T發(fā)卡結(jié)構(gòu)①②第88頁/共163頁③避免形成引物二聚體（dimer）兩個引物之間不能有兩個以上的連續(xù)堿基序列互補。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2第89頁/共163頁5）引物的Tm值Tm=（G+C）4+（A+T）2當(dāng)引物中的（G+C）含量低于50%時，復(fù)性溫度低于55℃。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。實際復(fù)性溫度選擇低于Tm值5℃。手工計算：一般估計：第90頁/共163頁6）引物的濃度一般使用終濃度各0.5mol/L。7）簡并引物如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物。第91頁/共163頁設(shè)計多組引物，結(jié)合位點依次位于前一組引物之間。增加擴增產(chǎn)物的特異性。引物設(shè)計現(xiàn)在多用專業(yè)軟件如Primer5.0等。8）套嵌引物（nestedprimers）1324第92頁/共163頁第93頁/共163頁但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。②

模板的量：

不能太多，100l反應(yīng)體系中100ng足夠。①

純度：PCR對模板DNA的純度要求不高。4.模板（template）第94頁/共163頁

dNTPs是

dATP、dTTP、dCTP和dGTP的總稱。一般反應(yīng)體系中dNTP混合液終濃度用0.2mmol/L。濃度過高會抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加錯配率。5.dNTPs第95頁/共163頁TaqDNA聚合酶要求有游離的Mg2+

。

所以Mg2+濃度不能太低。但太高會增加非特異產(chǎn)物（雜帶）。一般用1.5

mmol/L～4.5mmol/L的MgCl2終濃度。6.Mg2+的濃度第96頁/共163頁借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物?？梢宰龅絇CR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)Ct值確定起始DNA的拷貝數(shù)，做到真正意義上的DNA定量。

1）熒光實時定量PCRReal—time

PCR（或TaqMan

PCR）Ct值：樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.2.3.6PCR技術(shù)的擴展第97頁/共163頁擴增兩個引物外側(cè)的未知序列把線性DNA模板轉(zhuǎn)變成環(huán)形分子。templatetemplate3’

5’

5’

3’

（傳統(tǒng)PCR只擴增兩個引物之間的已知序列）。技術(shù)關(guān)鍵：2）反向PCR第98頁/共163頁使引物的外側(cè)序列“轉(zhuǎn)變”成內(nèi)側(cè)序列。第99頁/共163頁TeminH.發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶，

1975諾貝爾獎技術(shù)關(guān)鍵：利用反轉(zhuǎn)錄酶，把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增。3）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）第100頁/共163頁提取基因組

totalRNA反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板PCR擴增根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。適合擴增真核生物基因。第101頁/共163頁目的基因的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA第一鏈目的基因的引物2目的

基因cDNA第二鏈PCRmRNA第102頁/共163頁1）擴增某一段DNA從基因組中擴增；從載體上擴增；組織樣本原位擴增；微量殘留DNA擴增；分析模板序列；1.2.3.7PCR技術(shù)的應(yīng)用第103頁/共163頁在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復(fù)、插入、替換等）。技術(shù)關(guān)鍵：利用引物的5’端序列不要求與模板嚴(yán)格配對，設(shè)計引物時引入突變序列。2）基因的體外誘變第104頁/共163頁利用6bp長度的隨機序列引物擴增細(xì)胞中的總DNA，將會得到許多非特異性產(chǎn)物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。比較不同物種之間的基因組特征和相似性。類似于限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性（RFLP）分析，因而也稱為隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）分析。RAPD（RandomamplifiedpolymorphismDNA）3）基因組的比較研究第105頁/共163頁作業(yè)反轉(zhuǎn)錄引物第106頁/共163頁

當(dāng)帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起時，其特定的同源區(qū)段會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)，如果彼此退火的核酸來自不同的生物，則所形成的雙鏈分子就叫雜種核酸分子。廣泛地應(yīng)用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病的診斷等方面。1.2.4

核酸的分子雜交第107頁/共163頁基本理論

DNA變性

DNA復(fù)性核酸分子雜交印記在雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子都是在雜交之前通過毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，且按其在凝膠中的位置原位地”復(fù)印”上去。第108頁/共163頁

DNA-DNA或DNA-RNA鏈雜交。用放射性同位素（32P或125I）標(biāo)記的DNA或RNA探針。雜交的一般程序第109頁/共163頁核酸探針與被測樣品中的目的DNA相應(yīng)序列互補的已知核酸片斷，可以是人工合成的寡核苷酸，基因組DNA，特異的PCR產(chǎn)物，cDNA，單鏈DNA及RNA。探針標(biāo)記物要求：不影響探針的主要理化性質(zhì)；靈敏度高，特異性強，重復(fù)好；操作簡便；穩(wěn)定性高，易于保存；安全，無污染。第110頁/共163頁標(biāo)記物的類型：

1）放射性標(biāo)記物：用放射性同位素對核苷酸進(jìn)行標(biāo)記后的產(chǎn)物。32P、3H、35S、14C2）非放射性標(biāo)記物：無放射性污染，分辨力高，穩(wěn)定性好，但敏感性及特異性較差。生物素標(biāo)記的核苷酸。標(biāo)記探針的方法：

1）體內(nèi)標(biāo)記

2）體外標(biāo)記：化學(xué)法和酶促法第111頁/共163頁用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。1.2.4.1Sorthernblotting第112頁/共163頁第113頁/共163頁Southernblotting篩選結(jié)果第114頁/共163頁用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。用于研究基因表達(dá)1.2.4.2Northernblotting第115頁/共163頁變性凝膠電泳：單鏈RNA易形成高級結(jié)構(gòu)，使用變性劑有甲醛，乙二醛，尿素等。電泳過程中始終要有抑制RNase作用。雜交前，干燥后的固相膜會由于變性劑的存在而干擾雜交靈敏度，先將膜泡在Tris-His緩沖液中95度5-10分鐘，可洗脫與RNA結(jié)合的甲醛。第116頁/共163頁對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落，需要目的基因的探針。1.2.4.3菌落原位雜交第117頁/共163頁菌落原位雜交第118頁/共163頁作業(yè)核酸分析技術(shù)第119頁/共163頁組織原位雜交組織原位雜交指DNA探針與染色體DNA的雜交，或mRNA與細(xì)胞中的RNA的雜交，用于基因在轉(zhuǎn)錄水平的亞細(xì)胞定位。斑點雜交免疫印記（westernblotting）1.2.4.4其它方法第120頁/共163頁1970年人們就有足夠的理論知識來提出目前所用的快速DNA序列分析法。但當(dāng)時在認(rèn)識上和技術(shù)上存在兩個問題：當(dāng)時沒有能把不同長度的核苷酸片斷分離開的技術(shù)。當(dāng)時的分析思路局限于RNA序列分析法。（1965年Cornell大學(xué)的S.W.Holley等首次測定了75bp的酵母丙氨酸t(yī)RNA全序列。使用的是降解片斷法）。1.2.5DNA序列分析第121頁/共163頁Sanger等1977年發(fā)明。FrederickSanger，1980年NobelPrize化學(xué)獎1.2.5.1雙脫氧鏈終止法第122頁/共163頁DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按堿基配對的原則進(jìn)行的。脫氧核糖的連接是以3’5’磷酸二脂鍵。復(fù)制反應(yīng)可以在體外進(jìn)行。2’和3’雙脫氧的ddNTP會使復(fù)制反應(yīng)終止。

1）原理第123頁/共163頁第124頁/共163頁第125頁/共163頁制備單鏈DNA模板就是待測序的

DNA鏈。①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；②與模板的親和力高，不會提前脫離模板。

特殊的DNA多聚酶

dNTP/ddNTP=3/1時，DNA電泳帶譜的分離效果最好，可讀出200多個核苷酸序列。制備2’和3’雙脫氧的ddNTP2）技術(shù)要點第126頁/共163頁需帶有放射性或熒光標(biāo)記。制備一小段單鏈引物（DNA或RNA）或?qū)dNTP帶上標(biāo)記第127頁/共163頁3）Sanger雙脫氧終止法測序過程第128頁/共163頁第129頁/共163頁模板序列第130頁/共163頁1977年，哈佛大學(xué)的A.M.Maxam和W.Gilbert發(fā)明。WalterGilbert，1980年NobelPrize化學(xué)獎1.2.5.2Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法第131頁/共163頁末端放射性標(biāo)記的DNA片單鏈長度最少差一個核苷酸的DNA鏈混合物化學(xué)試劑處理凝膠電泳放射性自顯影閱讀堿基順序特定的堿基中引入化學(xué)基團DNA在被修飾的核苷酸位置斷裂1）原理第132頁/共163頁堿基特異切割方法G用硫酸二甲脂對N7進(jìn)行甲基化，修飾的G在中性環(huán)境和高溫下會斷裂。A+GpH2.0，哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化，從而導(dǎo)致脫嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵。C+T肼可打開嘧啶環(huán)，哌啶進(jìn)一步從T和C處斷裂。C在1.5mol/LNaCl存在時，可用肼除去胞嘧啶。2）堿基特異的化學(xué)切割法第133頁/共163頁3）測序過程第134頁/共163頁每組反應(yīng)只針對特定的堿基，共有4組反應(yīng)，可分別顯示G、A+G、C、C+T的終止位置。特點：讀出的序列就是要測的序列。Sanger測序法讀出的序列是新合成的互補鏈序列。第135頁/共163頁第136頁/共163頁第137頁/共163頁測序讀片第138頁/共163頁

90年代初期由英國、前南斯拉夫和俄羅斯的4個科學(xué)家小組同時提出來的。用特定長度的具有所有可能堿基序列的寡核苷酸群體，與未知序列的DNA片斷雜交，根據(jù)某些寡核苷酸探針形成的完全雙鏈推知目的DNA的堿基序列。原理

1）只有完全互補的DNA序列才能雜交形

成完全的雙鏈分子。雜交效率最高。2）有個別不互補堿基時，雜交效率下降。3）非互補堿基越多，雜交效率越差。1.2.5.3DNA雜交測序第139頁/共163頁4）用一段寡聚核苷酸（8-mer）的所有可能的堿基排列序列作探針。8mer探針有48=65536種序列。如：

8-mer靶DNA同65536中的一種探針完全雜交形成完全互補雙鏈。

5）根據(jù)雜交效率可推斷出靶DNA的序列。5’-AGCCTAGC-3’

Target3’-TCGGATCG-5’

Probe假如探針序列已知，則可推知靶DNA序列。

第140頁/共163頁但：12me