實(shí)驗(yàn)二土壤中微生物的分離純化及觀察第1頁/共26頁實(shí)驗(yàn)一微生物的分離純化、平板菌落計(jì)數(shù)及觀察微生物的分離純化、平板菌落計(jì)數(shù)及觀察第2頁/共26頁

目的要求1.掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)。2.觀察并識(shí)別微生物的菌落特征（群體形態(tài)）。（一）微生物的分離純化及觀察第3頁/共26頁基本原理

從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。

1.簡易單細(xì)胞挑取法（簡易單孢子分離法）2.平板分離法

選擇適宜的培養(yǎng)基，微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個(gè)菌落可以是由一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體。挑取單菌落可獲得一種純培養(yǎng)。方法：稀釋涂布平板法、平板劃線分離法第4頁/共26頁器材分離源：自采集土壤樣品培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基、馬丁氏（孟加拉紅）培養(yǎng)基溶液或試劑盛4.5ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶。儀器或其他用具振蕩器，無菌培養(yǎng)皿，無菌吸管，接種環(huán)，電磁爐，培養(yǎng)箱，吸耳球等。第5頁/共26頁1、編號(hào)：取無菌平皿１８個(gè)。另取無菌水４支，依次標(biāo)明10-2、10－3、10-4、10-5。2、倒平板：分別將三種培養(yǎng)基溶化后，冷卻至55～60℃時(shí)，每種培養(yǎng)基各倒６皿，標(biāo)注培養(yǎng)基名稱。其中，高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基在倒入前需先添加１０滴10%的苯酚。一、稀釋涂布平板法（全組完成）第6頁/共26頁3、制備土壤稀釋液

0.5ml各4.5ml無菌水各取稀釋樣0.１ml涂布放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只接觸一個(gè)稀釋度。牛肉膏平板馬丁氏平板10－210-3

10-4

10-510-110-210-310-410-5

0.5ml0.5m0.5ml高氏Ⅰ號(hào)平板第7頁/共26頁

４、涂布

５、培養(yǎng)

將高氏Ⅰ號(hào)平板、馬丁氏平板倒置于28℃培養(yǎng)３～５d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培養(yǎng)培養(yǎng)1～2d。

６、菌落觀察

觀察并描述土壤樣品中分離到的細(xì)菌、放線菌、霉菌的菌落特征。

第8頁/共26頁７、挑菌落將培養(yǎng)出的單菌落進(jìn)行斜面接種，并分別置37℃和28℃溫室中培養(yǎng)，此后鏡檢是否為單一微生物。若有雜菌，繼續(xù)分離純化。

第9頁/共26頁二、平板劃線分離法（個(gè)人完成）1、倒平板：將３種培養(yǎng)基溶化后，各倒一皿。并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、樣品編號(hào)、個(gè)人學(xué)號(hào)等。2、劃線：分別挑取土壤樣品中10－1的土壤懸液一環(huán)，在三種平板上劃線，以分離細(xì)菌、放線菌、霉菌。

分區(qū)劃線、連續(xù)劃線第10頁/共26頁分區(qū)劃線（適用于濃度較大的樣品）連續(xù)劃線（適用于濃度較小的樣品）第11頁/共26頁3、培養(yǎng)將高氏Ⅰ號(hào)平板、馬丁氏平板倒置于28℃培養(yǎng)３～５d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培養(yǎng)培養(yǎng)1～2d。4、菌落觀察５、挑菌

挑取單個(gè)菌落接種到斜面上培養(yǎng)，此后鏡檢是否為單一微生物。若有雜菌，繼續(xù)分離純化。第12頁/共26頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(P３4五、１.(２、３)

你所做的涂布平板法和劃線法是否較好地得到了單菌落？如果不是，請(qǐng)分析其原因。在不同的平板上你分離得到了哪些類群的微生物？簡述它們的菌落特征。第13頁/共26頁思考題如何確定平板上某個(gè)單菌落是否為純培養(yǎng)？請(qǐng)寫出實(shí)驗(yàn)的主要步驟。(P３4五.2.(1))如果一項(xiàng)科學(xué)研究內(nèi)容需從自然界中篩選到能產(chǎn)高溫蛋白酶的菌株，你將如何完成？請(qǐng)寫出簡明的實(shí)驗(yàn)方案。第14頁/共26頁(二)、平板菌落計(jì)數(shù)法目的要求學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。基本原理通過將樣品制成均勻的一系列不同稀釋度的稀釋液，使樣品中的微生物細(xì)胞充分分散，成單個(gè)細(xì)胞存在，再取一定量的稀釋液接種，使其均勻分布于培養(yǎng)皿中特定的選擇性培養(yǎng)基內(nèi)。統(tǒng)計(jì)數(shù)量時(shí)，根據(jù)稀釋倍數(shù)與取樣量、平板上長出的菌落數(shù)計(jì)算出每克或每毫升樣品中的微生物數(shù)（CFU）。第15頁/共26頁實(shí)驗(yàn)器材菌種：大腸桿菌菌懸液培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基儀器或其他用具：1mL無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5mL無菌水的試管等。兩種計(jì)數(shù)方法傾注法（本次實(shí)驗(yàn)）涂布法第16頁/共26頁操作步驟（全組完成）1.編號(hào)：取無菌平皿9個(gè)，分別表明10－4、10-5、10-6（稀釋度）各三套。另取無菌水6支，依次標(biāo)明10－1、10-2、10－3、10-4、10-5、

10-6。第17頁/共26頁10-410-510-6原樣10-110-210-310-410-510-60.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.2ml0.2ml0.2ml2.稀釋:3.取樣0.5ml第18頁/共26頁4.倒平板：倒入融化后冷卻至45℃的培養(yǎng)基15～２５ml，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻。5.培養(yǎng)：37℃倒置培養(yǎng)48h。６.計(jì)數(shù)：選擇每個(gè)平板上長有30~300個(gè)菌落數(shù)的稀釋度計(jì)算樣品含菌量。第19頁/共26頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果P34表格依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析本次數(shù)據(jù)是否可靠。計(jì)算每毫升大腸桿菌菌懸液的含菌量。第20頁/共26頁思考題（P34（3）（5）（6）(7)）

為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板？要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵？為什么？當(dāng)你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時(shí)，你認(rèn)為問題出在哪里？用傾注法和涂布法計(jì)數(shù)，其平板上長出的菌落有何不同？為什么要培養(yǎng)較長時(shí)間（48h）后觀察結(jié)