第一章微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第一頁，共三十頁，2022年，8月28日第一節(jié)微生物的純培養(yǎng)技術(shù)一.純培養(yǎng)的分離方法（一）稀釋法（二）平板劃線分離法（三）單細(xì)胞（單孢子）挑取法（四）利用選擇培養(yǎng)基分離法二.無菌技術(shù)三.微生物的保藏技術(shù)第二頁，共三十頁，2022年，8月28日幾個概念：純培養(yǎng)技術(shù)：把特定微生物從自然界混雜存在的狀態(tài)中分離、純化出來的技術(shù)。純培養(yǎng)（pureculture）：微生物學(xué)中將在實驗室條件下，從一個細(xì)胞或一種細(xì)胞群繁殖得到的后代，稱為純培養(yǎng)?；旌吓囵B(yǎng)物：含有兩種以上微生物的培養(yǎng)物。二元培養(yǎng)物：只含有二種微生物，并保持二者之間特定關(guān)系的培養(yǎng)物。第三頁，共三十頁，2022年，8月28日平板（cultureplate）：即培養(yǎng)平板的簡稱，指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的平皿。菌落（colony）：生長在固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部，來源于一個細(xì)胞、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的、肉眼可見的子細(xì)胞群體。菌苔（lawn）：眾多菌落在固體培養(yǎng)基表面連成一片時，稱為菌苔。第四頁，共三十頁，2022年，8月28日一.純培養(yǎng)的分離方法

（一）稀釋法1.固體稀釋倒平板法：將待分離材料作一系列稀釋（1/10，1/100，1/1000，…），→取不同吸收液各少許與已熔化并冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，→搖勻后傾入滅菌過的培養(yǎng)皿中→凝固后保溫培養(yǎng)一定時間→挑取單個菌落，重復(fù)以上過程→獲得純培養(yǎng)。第五頁，共三十頁，2022年，8月28日第六頁，共三十頁，2022年，8月28日2.涂布平板法：與上法相似，不同之處在于：先制平板→將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面→用無菌涂棒將菌液涂勻→培養(yǎng)→挑取單個菌落，重復(fù)以上過程→獲得純培養(yǎng)。第七頁，共三十頁，2022年，8月28日3.液體稀釋法：適于細(xì)胞較大的微生物待分離材料→接種于培養(yǎng)液中→培養(yǎng)→測定或估計單位容積中的含菌數(shù)目→稀至兩、三滴液體中只含有一個微生物個體→每次取一滴至另一盛有新鮮培養(yǎng)基的試管中→搖勻，培養(yǎng)→觀察→大多數(shù)試管無微生物生長，少數(shù)管底有一菌落，可能由一個細(xì)胞繁殖而來。第八頁，共三十頁，2022年，8月28日

4.稀釋搖管法：適于分離嚴(yán)格厭養(yǎng)菌。一系列盛由固體培養(yǎng)基的試管→加熱熔化→冷卻至50℃左右℃保溫℃加入待分離材料進(jìn)行梯度稀釋→迅速搖勻→冷凝→傾注一層滅菌過的石蠟→培養(yǎng)→挑取單個菌落。；第九頁，共三十頁，2022年，8月28日第十頁，共三十頁，2022年，8月28日（二）平板劃線分離法方法：制平板→用接種環(huán)沾取少許待分離材料→在培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線，隨著接種環(huán)的移動，微生物得以分散→培養(yǎng)→在畫線的后面部位可形成單獨的菌落→挑取單個菌落→培養(yǎng)→獲得純培養(yǎng)第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日（三）單細(xì)胞（單孢子）挑取法適用于分離混雜微生物中弱勢群體。方法：（1）用顯微操作儀在顯微鏡下用毛細(xì)吸管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取→獲得純培養(yǎng)。（2）用一般顯微鏡，將一滴經(jīng)適當(dāng)稀釋后的菌液置于載玻片上，選取只含有一個細(xì)胞的液滴進(jìn)行純培養(yǎng)的分離。此法多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日（四）利用選擇培養(yǎng)基分離法1.抑制其它微生物的生長：控制pH、溫度，加抗生素等

2.富集培養(yǎng)：光照、溫度、高壓、紫外線、氧氣、營養(yǎng)等。通過設(shè)置有利于某些或某一微生物生長的特定條件，使適應(yīng)該條件的微生物旺盛生長。此法易分離到某些特定微生物或弱勢微生物。第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日二.無菌技術(shù)1.常用器具的滅菌常用器具：試管、燒瓶、培養(yǎng)皿、涂棒、移液管、接種環(huán)等方法：這些器具在滅菌前須先進(jìn)行包扎或裝入特定容器中。（1）高壓蒸汽滅菌0.1MPa121.3℃15~30min（2）高溫干熱滅菌160~170℃2h（3）燒灼滅菌第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日2.培養(yǎng)基的滅菌：高壓蒸汽滅菌過濾滅菌：適于不耐溫的材料3.無菌操作：在火焰旁或無菌箱、超凈工作臺上操作。第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日三.微生物的保藏技術(shù)（一）保藏目的在菌種一定時間內(nèi)不死亡、不變異（丟失重要的生物學(xué)性狀）、不被污染。（二）保藏原理根據(jù)微生物的生理生化特性，人工創(chuàng)造不適宜微生物生長繁殖的條件，降低代謝能力，以保持其遺傳性、減少變異性，達(dá)到長期保藏的目的。休眠或半休眠第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日（三）保藏方法

1.低溫保藏法：（1）傳代培養(yǎng)保藏(冰箱保藏法、定期移植法）（2）超低溫保藏法液氮（-195℃）低溫冰箱

2.干燥保藏法：沙土管保藏法

3.隔絕空氣保藏法冷凍真空干燥保藏法第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日第二節(jié)顯微技術(shù)一.普通光學(xué)顯微鏡（一）油鏡的工作原理

加油原因：

1.增加視野亮度

2.增加分辨率：最小可分辨距離=λ/2NANA=n.Sinα第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日（二）使用方法第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日二、暗視野顯微鏡觀察細(xì)菌的運動性三、相差顯微鏡觀察細(xì)微結(jié)構(gòu)四、熒光顯微鏡特殊成分第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日

第二十七頁，共三十頁，2022年，8月28日五.電子顯微鏡以電子束為光源，因波長縮短，故分辨率提高。透射電鏡的樣品制備及觀察：

1.金屬網(wǎng)的處理載網(wǎng)200~400目的銅網(wǎng)

2.支持膜的制備塑料膜、碳膜、金屬膜

3.將支持膜轉(zhuǎn)移到至載網(wǎng)上

4.制片：滴液法、超薄切片法、復(fù)型法、冰凍蝕刻法等

5.觀察

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第二十八頁，共三十頁，2022年，8月28日第二十九頁，共三