專題一基因工程選修三DNA重組技術的基本工具基因工程的基本操作程序基因工程的應用蛋白質工程的崛起第1頁/共93頁第2頁/共93頁蘇云金芽孢桿菌毒蛋白第3頁/共93頁第4頁/共93頁

按照人們的愿望，在DNA分子水平上進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉基因技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。一、基因工程的概念第5頁/共93頁別名操作環(huán)境操作對象操作水平原理結果DNA重組技術生物體外基因DNA分子水平定向地改造生物的遺傳性狀基因重組一、基因工程的概念第6頁/共93頁基因工程操作依據(jù)的理論基礎細胞生物都以DNA作為遺傳物質，且其基本結構是相同的；各種生物表達基因共用一套密碼子。第7頁/共93頁棉花細胞(不能抗蟲)抗蟲基因轉基因抗蟲棉(能抗蟲)蘇云金芽孢桿菌目的基因提取導入剪刀針線運載體檢測表達受體細胞分子手術刀分子縫合針分子運輸車培育轉基因抗蟲棉的簡要過程第8頁/共93頁項目內容來源種類及命名作用特點作用結果主要來源于原核生物屬名頭字母+種名頭2字母現(xiàn)已從300微生物中分離出約4000種限制酶1.分子手術刀——限制酶

第9頁/共93頁識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列切割特定序列中的特定位點專一性第10頁/共93頁第11頁/共93頁限制酶作用的化學鍵第12頁/共93頁項目內容來源種類及命名作用特點作用結果主要來源于原核生物屬名頭字母+種名頭2字母現(xiàn)已從300微生物中分離出約4000種限制酶1.分子手術刀——限制酶

能夠識別雙鏈DNA分子某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。黏性末端或平末端

第13頁/共93頁DNA1CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTDNA2GGCATCTTAAAATTCCGTAG

重組DNAGGCATCTTAAAATTCCGTAG由于切割后的載體和目的基因具有相同的末端，故重組DNA存在3中可能連接。即

、

、

。重組DNA一定是載體-目的基因連接嗎？載體-目的基因載體-載體目的基因-目的基因DNA連接酶連接重組DNA分子第14頁/共93頁項目內容種類作用部位結果E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶只作用于

末端主要作用于

末端，還可作用于

末端磷酸二酯鍵黏性平黏性通過形成新的磷酸二酯鍵，形成重組DNA2.分子縫合針——DNA連接酶第15頁/共93頁復習基因工程的原理？基因工程的基本工具？限制酶的作用特點及作用結果？DNA連接酶的種類及作用特點？DNA連接酶和DNA聚合酶的比較？第16頁/共93頁DNA連接酶DNA聚合酶作用實質作用過程催化兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸加到DNA片段上，形成磷酸二酯鍵第17頁/共93頁項目內容作用具備條件種類質粒③能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定地保存；目的基因怎樣才能遺傳到子細胞呢？將外源基因導入受體細胞④具有特殊的標記基因，便于進行篩選；質粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒一種祼露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，能夠自我復制的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。①對受體細胞無害②具有一個或多個限制酶切點，以便與外源基因插入；載體能對受體細胞有害嗎？載體怎樣才能具有能連接不同目的基因的潛能呢？目的基因是否進入受體細胞，你如何察覺？3.分子運輸車——載體第18頁/共93頁

已知標記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因，現(xiàn)探討某細菌的質粒中有無標記基因或標記基因是什么？請設計實驗、預期實驗結果，并得出相應的實驗結論。不添加抗生素添加一定濃度的四環(huán)素添加一定濃度的氨芐青霉素添加一定濃度的兩種抗生素ABCD練習第19頁/共93頁A組B組C組D組結論預期一＋＋＋＋預期二＋＋－－預期三＋－＋－預期四＋－－－既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因只含有抗四環(huán)素基因只含有抗氨芐青霉素基因既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因不添加抗生素添加一定濃度的四環(huán)素添加一定濃度的氨芐青霉素添加一定濃度的兩種抗生素ABCD第20頁/共93頁第21頁/共93頁三大工具分子手術刀——限制性內切酶分子縫合針——DNA連接酶分子運輸車——運載體小節(jié)：基因工程的工具第22頁/共93頁非編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞基因結構示意圖啟動子終止子mRNA第23頁/共93頁非編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)真核細胞基因結構示意圖啟動子外顯子內含子終止子成熟mRNA第24頁/共93頁第25頁/共93頁目的基因的獲取基因表達載體的構建目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉化。才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。基因工程基本操作的四個步驟1234第26頁/共93頁（一）目的基因主要是______________________。編碼蛋白質的結構基因（三）獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術擴增3、化學方法人工合成一、目的基因的獲?。ǘ┠康幕虻膩碓矗?、從自然界中已有物種中分離出來2、人工的方法合成第27頁/共93頁1.基因文庫：2.基因文庫的分類：種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫（一）從基因文庫中直接獲取第28頁/共93頁第29頁/共93頁提取某種生物的全部DNA限制酶切一定大小的DNA片段與載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫3.基因文庫的構建方法（1）基因組文庫第30頁/共93頁某種生物的單鏈mRNA單鏈互補DNA雙鏈DNA片段導入受體菌中儲存與載體連接cDNA文庫逆轉錄酶DNA聚合酶（2）部分基因文庫第31頁/共93頁第32頁/共93頁文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小啟動子內含子基因多少物種間基因交流第33頁/共93頁1.概念：PCR全稱為_________________，是一項在生物______復制_______________的核酸合成技術。多聚酶鏈式反應體外特定DNA片段2.原理：體外模擬雙鏈DNA復制（二）利用PCR技術擴增目的基因

第34頁/共93頁四種脫氧核苷酸(dNTP)

一對引物：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(含有目的基因)

3.條件：與目的基因的起始段互補核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列4.前提：第35頁/共93頁變性（90℃-95℃）：目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈；復性（55℃-65℃）：引物與單鏈相應互補序列結合；延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的DNA鏈；約2n

第36頁/共93頁5.過程第37頁/共93頁PCR技術擴增與DNA復制的比較PCR技術DNA復制相同點原料條件不同點解旋方式場所酶結果四種脫氧核苷酸模板、能量、酶高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制主要細胞核內熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子第38頁/共93頁蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學合成例：根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：（三）化學方法人工合成的目的基因適用：基因比較小，核苷酸序列已知第39頁/共93頁1.目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。二、基因表達載體的構建第40頁/共93頁2.基因表達載體的組成：啟動子+目的基因+終止子+標記基因第41頁/共93頁（一）轉化：（二）方法目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程。受體細胞穩(wěn)定表達三、將目的基因導入受體細胞第42頁/共93頁1、將目的基因導入植物細胞的方法：（1）農桿菌轉化法

①農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。②原理：植物體受損傷時，傷口細胞會分泌酚類化合物，吸引農桿菌，農桿菌的Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。第43頁/共93頁③過程：④優(yōu)點：經濟有效第44頁/共93頁（2）基因槍法

（3）花粉管通道法缺點：成本較高受體細胞(單子葉植物)我國科學家獨創(chuàng)，轉基因抗蟲棉第45頁/共93頁2、將目的基因導入動物細胞①方法：顯微注射法②程序：③常用的動物受體細胞：受精卵和卵細胞第46頁/共93頁3、將目的基因導入微生物細胞①原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質少②方法：

用Ca2+處理細胞→感受態(tài)細胞(吸收環(huán)境中DNA生理狀態(tài))→表達載體(緩沖液)與感受態(tài)細胞混合→(溫度)感受態(tài)細胞吸收DNA分子第47頁/共93頁（二）方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞法三、將目的基因導入受體細胞第48頁/共93頁四、目的基因的檢測與鑒定（一）檢測（分子水平）1、檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因①提取轉基因生物的基因組DNA②用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記，以此做探針③使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶，表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:第49頁/共93頁第50頁/共93頁2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質（1）方法:分子雜交方法:抗原-抗體雜交（2）過程:

用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA第51頁/共93頁（二）鑒定（個體生物學水平）抗蟲、抗病接種實驗，活性比較等第52頁/共93頁人體細胞質粒大腸桿菌目的基因(人胰島素基因)用同一種限制酶進行酶切DNA連接酶連接目的基因和質粒重組質粒(重組DNA)重組質粒導入大腸桿菌細胞繁殖人胰島素復制目的基因第53頁/共93頁獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因利用PCR技術擴增目的基因化學方法人工合成目的基因構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞植物、動物、微生物目的基因的檢測與鑒定檢測：分子水平是否插入、轉錄、翻譯鑒定：個體水平小節(jié):基因工程的基本操作程序第54頁/共93頁基因工程的基本工具？限制酶的特點？DNA連接酶和載體的種類？基因工程的基本操作程序？獲取目的基因的方法？基因工程的核心步驟是？基因表達載體的組成？將抗蟲基因轉移到棉花細胞中遺傳和表達稱為？將目的基因導入植物、動物、微生物細胞的方法？T-DNA的特點？目的基因能否在受體細胞中穩(wěn)定遺傳的關鍵？目的基因的檢測與鑒定的方法？復習第55頁/共93頁第56頁/共93頁一、植物基因工程碩果累累轉基因工程技術主要用于提高農作物的抗逆能力,以及改良農作物的品質和利用植物生產藥物等方面。第57頁/共93頁(一)抗蟲轉基因植物殺蟲基因：Bt毒蛋白基因蛋白酶抑制劑基因淀粉酶抑制劑基因植物凝集素基因第58頁/共93頁Bt毒蛋白基因蛋白酶抑制劑基因淀粉酶抑制劑基因植物凝集素基因產生的抑制劑可與害蟲消化道的蛋白酶結合淀粉酶抑制劑抑制昆蟲消化道中的淀粉酶活性合成的糖蛋白可與昆蟲腸道粘膜上的某種物質結合編碼的蛋白質在害蟲腸道降解成有毒的多肽轉基因抗蟲棉第59頁/共93頁(二)抗病轉基因植物病原微生物：主要有病毒、真菌和細菌等。第60頁/共93頁抗病轉基因植物采用的基因：抗真菌轉基因植物采用的基因：病毒外殼蛋白基因（CP基因）病毒復制酶基因幾丁質酶基因抗毒素合成基因第61頁/共93頁(三)抗逆轉基因植物可以調節(jié)細胞滲透壓的基因抗凍蛋白基因抗除草劑基因第62頁/共93頁(四)利用轉基因改良植物的品質將必需氨基酸含量多的蛋白質編碼基因導入植物；改變這些氨基酸合成途徑中某種關鍵酶的活性。例如：將富含賴氨酸的蛋白質編碼基因導入玉米，賴氨酸含量提高30%。第63頁/共93頁將控制番茄果實成熟的基因導入番茄，獲得轉基因延熟番茄；將植物花青素代謝有關的基因導入花卉植物矮牽牛中，出現(xiàn)顏色變異。第64頁/共93頁二、動物基因工程前景廣闊1.用于提高動物生長速度2.用于改善畜產品的品質外源生長素基因將腸乳糖酶基因導入奶牛基因組普通鼠和生長速度加快的轉基因鼠（右）第65頁/共93頁3.用轉基因的動物生產藥物乳腺生物反應器乳房生物反應器將藥用蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調控組件重組在一起。第66頁/共93頁獲取目的基因（例如血清蛋白基因）構建基因表達載體（在血清白蛋白基因前加特異表達的啟動子）顯微注射導入哺乳動物受精卵中形成胚胎將胚胎送入母體動物發(fā)育成轉基因動物（只有在產下的雌性動物個體中，轉入的基因才能表達）第67頁/共93頁4.用轉基因的動物作器官移植的供體1、供體動物：2、存在的難題：3、解決方法：將供體基因組導入某種基因調節(jié)因子，以抑制抗原決定基因的表達；或設法除去抗原決定基因，再結合克隆技術，培育出沒有免疫排斥反應的轉基因克隆豬器官。豬免疫排斥第68頁/共93頁三.基因工程藥品異軍突起利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生產出各種高質量、低成本的藥品。我國已生產的產品：白細胞介素-2、干擾素、乙肝疫苗等。近20種，年產值達30億。工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表達的菌類細胞株系。第69頁/共93頁

作用：胰島素是治療糖尿病的特效藥。傳統(tǒng)生產方法：主要從豬、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取4~5g胰島素。產量低，價格昂貴?；蚬こ谭椒ǎ?979年，科學家將動物體內的胰島素基因與大腸桿菌DNA分子重組，并在大腸桿菌內實現(xiàn)了表達。

1982年，美國一家基因公司用基因工程方法生產的胰島素投入市場，售價降低了30%~50%?；蚬こ趟幤贰葝u素第70頁/共93頁基因工程藥品——干擾素化學本質：是病毒侵入動物或人體細胞后產生的一種糖蛋白。作用：抗病毒的特效藥。干擾素產品第71頁/共93頁基因工程藥品——生長激素治療侏儒癥的唯一方法：是向人體注射生長激素。傳統(tǒng)生產方法：需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長激素?；蚬こ谭椒?，將人的生長激素基因導入大腸桿菌中，使其生產生長激素。人們從450L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當于6萬具尸體的全部產量。第72頁/共93頁四、基因治療曙光初照1）原理：把正?；驅氩∪梭w內，使該基因的表達產物發(fā)揮功能，達到治療疾病的目的。2）實例：復合型免疫缺陷癥第73頁/共93頁3）基因治療的方法①體外基因治療：②體內基因治療：先從病人體內獲得某種細胞(T細胞)，進行培養(yǎng)，體外進行基因轉移，篩選成功細胞擴增培養(yǎng)，最后重新輸入患者體內。直接向人體組織細胞中轉移基因的治療方法。第74頁/共93頁4）用于基因治療的基因種類1.正常基因取代病變基因；彌補病變基因；2.反義基因產生mRNA與病變mRNA互補；3.編碼可以殺死癌細胞的蛋白酶基因；第75頁/共93頁多聚半乳糖醛酸酶(PG)能降解果膠使細胞壁破損。成熟的番茄果實中，PG合成顯著增加，能使果實變紅變軟，但不利于保鮮。利用基因工程減少PG基因的表達，可延長果實保質期。科學家將PG基因反向接到Ti質粒上，導入番茄細胞中，得到轉基因番茄，具體操作流程如圖。據(jù)圖回答下列問題：(原生質體是去掉細胞壁的植物細胞)第76頁/共93頁(1)若已獲取PG的mRNA，可通過________獲取PG基因。重組質粒轉移到大腸桿菌中的目的是__________________________________________________________________。第77頁/共93頁(2)用含目的基因的農桿菌感染番茄原生質體后，可用含有________的培養(yǎng)基進行篩選，理由是________________________。之后，還需將其置于質量分數(shù)為25%的蔗糖溶液中，觀察細胞________現(xiàn)象來鑒別細胞壁是否再生。第78頁/共93頁(3)由于導入的目的基因能轉錄出反義RNA，且能與________互補結合，因此可抑制PG基因表達的翻譯過程。若______________，則可確定轉基因番茄培育成功。第79頁/共93頁第80頁/共93頁知識回顧基因工程的實質是什么？將一種生物的基因轉移到另一種生物體內，后者可以產生它本來不能產生的蛋白質，進而表現(xiàn)出新的性狀。思考：基因工程有沒有局限？基因工程產生的蛋白質有沒有不足？第81頁/共93頁1基因工程的局限性：a、基因工程在原則上只能生產自然界已存

在的蛋白質b、天然蛋白質不一定完全符合人類生產和

生活的需要2蛋白質工程的目的：生產符合人們生活需要的并非自然界已存在的蛋白質一、蛋白質工程崛起的緣由第82頁/共93頁例如：改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干擾素（絲氨酸）體外可以保存半年玉米中賴氨酸含量比較低天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（異亮氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍第83頁/共93頁1蛋白質工程的概念：以蛋白質分子的結構規(guī)律以及與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質進行改造，或制造一